Mathematical modeling of substrate utilization by simultaneous growth of Clostridium cadaveris and C. sporogenes in anaerobic digestion

Abstract

Biological processes, such as biological wastewater treatment and anaerobic digestion treating high concentration organic wastes, have traditionally been considered to be areas of low need for control or low flexibility of operations, and have been built with more capacity than designed factors to handle to process variation of loading rate. However, optimization of existing processes or control of processes is more important than development of new processes due to increasingly complex processes and strict legal regulations. However, for biological processes, the following difficulties exist compared to chemical processes: Process optimization and process control are difficult due to lack of understanding of microorganisms in clusters, lack of research on dynamic changes of microorganisms, lack of understanding on the effects of interaction between microorganisms, and difficulty in modelling relevant microorganism reactions. Modeling based on microbial dynamics mathematizes the relationship between microbial growth and substrate consumption. These models enhance understanding of biological processes and provide appropriate capacity calculations, optimum operation conditions, and biological control methodology for design, therefore studies on the development of mathematical models based on understanding the dynamic of microorganisms are drawn attraction. However, in the dynamic models used in the biological process, the microorganisms used in a single variable is not representative of interaction between microorganisms in the biological processes. Ecologically two or more species have many interactions and affect each other's growth. It is believed that two or more species of microorganisms using the same substrate as the "limiting nutrient" will have some formulation of interaction, and that by modifying them, more accurate biological process prediction and control can be achieved. The overall objective of this thesis is to develop the novel mathematical model that describes interspecies interactions, and to validate the developed model through the application of complex systems. In the first chapter, to develop a new model, it is important to select microbes to conduct experiments on. The invention of next-generation sequencing (NGS) technologies has granted a profound insight into microbial communities from various environmental matrixes. High-throughput sequencing methods enable identification of microorganisms in AD. The microbial community profile in anaerobic digesters can be identified using the 16S rRNA gene as a reliable phylogenetic marker. Hence, investigation of ‘core’ microorganisms (i.e., those that occur in all digesters during stable operation) in AD treating various organic wastes, becomes feasible to conduct by employing high-throughput sequencing methods. Core microorganisms play important roles in maintaining the stability of an anaerobic digester as they also have a strong ability to resist disturbance. Therefore, in this study, 22 full-scale anaerobic digesters were selected and monitored four times a year to examine core microorganisms. Core microorganisms found in 88 sample analyses in the year of this study are genera Clostridium, Syntrophomonas. Genus Syntrophomonas is not suitable for use in this study that must grow with methanogens with obligate relationship. Genus Syntrophomonas could not grow alone. Genus Clostridium finally selected, but this genus has about 150 species. Clostridium cadaveris was selected as final species because it is type species of this genus and partner species with this must have a similar niche (growth condition, growth rate). There were three species, Clostridium acetobutyliucm, Clostridium sporogenes, Clostridium sphenoides, which had a same growth condition such as temperature, pH, and nutrient. In order to compare growth rates, the experiment was conducted to derive the maximum specific growth rate (μm) and the half saturation coefficient (Ks) of four species. Species with very similar growth rates were determined as C. sporogenes, so we conducted a later experiment on the two species. To quantify selected microorganisms, the specific primer and probe set for target species was developed. In the second chapter, it was necessary to clearly understand what was happening in the natural phenomenon for constructing the new biological model. The new model could describe the interspecific interaction between species, and to quantify the interaction strength that the previous section revealed. The species, C. cadaveris, C. sporogenes, cultivated in pure and mixed culture. The new model is a combination of several parameters relevant and influential and state variables. An ideal model is general, realistic, and accurate. Two scientific hypotheses have been introduced to mathematize the interaction between species. First, change in microbial growth rate might be due to secreted chemical molecules (autoinducers) from other species. These molecules increase as cell population density increases. The models included new interaction terms that were proportional to the population densities of other species. Second, the effect of one species on another is a nonlinear function of cell-population density, so the new interaction terms in the model had nonlinear relationships with population densities. R2 and Alkaike information criterion (AIC) were used to compare for the new model candidate and the model with the higher R2 and lowest AIC value was selected. Among the new model, the mathematical form of interaction of the model is αXθ, which suggests that as the coefficient of α is multiplied to species population, its effect increases with the concentration of the population. This meant that an increase of chemical signaling compounds that cause interaction increased with species population. Second, the coefficient θ was calculated in exponential form, which meant that the increase of chemical signaling compounds had a nonlinear effect with species population. This included that the biological chemical signaling compounds did not increase or decrease in linear relation to the species population. In the third chapter, validation of newly developed models is critical. The models developed in the previous study were applied in batch systems, so in this study, dynamic changes in microorganisms and substrate concentration are predicted by new models under semi-continuous conditions. Mathematical scenarios are considered theoretically when there are two microorganisms sharing the same substrate at a given hydraulic retention time. The theory generally accepted in the ecosystem is that microorganism with a relatively high substrate affinity and a slow growth (k-strategy) win the final resource competition under conditions where various microorganisms (r-strategy) are sharing a single limiting resource. In this experiment, two species (Clostridium cadaveris and Clostrdium sporogenes) of microorganisms with very similar substrate affinity and growth rate are tested to avoid theoretically predictable situations. In addition, when steady state are reached, the accuracy of the model is verified by comparing the predicted microorganism and substrate concentrations by the new model with those obtained in the actual experiment. In this study, the dynamic change and population at steady-state of microorganisms in mixed culture and comparison with the predicted value of the developed model were shown. The population of C. cadaveris at steady-state was 0.89 ± 0.02 x 1011 copies/mL which was much closed to the predicted value (0.91 x 1011 copies/mL) in pure culture. C. sporogenes at steady-state was 0.43 ± 0.01 x 1011 copies/mL copies/mL which was much closed to the predicted value (0.45 x 1011 copies/mL) in pure culture. Competition for the same substrate occurred in mixed culture, resulting in only one species surviving. This was explained by the competitive exclusion principle among ecological theories, and the mathematical model developed. In mixed incubation, C. cadaveris reached steady-state through dynamic state. Its concentration at steady state was 0.88 ± 0.02 x 1011 copies/mL and was not significantly different from the predicted value of 0.91 x 1011 copies/mL of the developed model. C. sporogenes lost the competition and did not survive the system. In the last chapter, the developed model is to be applied to the full-scale biological wastewater treatment plant (WWTP) to verify its generality. While previous studies reviewed the application and predictability of the new models within the synthetic ecology system, this study aims to predict the WWTP performance by experimenting with microorganisms in WWTP with increased complexity. The biokinetic parameters is derived by applying the model developed on microbes from WWTP, and the process efficiency and microbial concentration of WWTP are predicted based on the model. The performance of WWTP is monitored twice a week. The total research period is eight weeks, and the accuracy of the new models is assessed in various environmental changes that may come from actual facilities. The newly developed model accurately predicted the residual ammonia concentration of WWTP and the dynamic change of the dominant species, N. europaea, but not the dynamic change of the non-dominant N. nitrosa. The reason for this was that the simulation was performed under the assumption that all variables except ammonia concentration and HRT was not limiting variable for microbial growth, but failed to predict N. nitrosa accurately due to the unexpected influent characteristics, nutrients other than ammonia, and various environmental conditions This results showed the predictability in similar situations occurring in the natural systems through the interspecific interaction model that describes the interaction between two species of microorganisms consuming the same substrate. The process efficiency and dynamic changes in microorganisms was predicted by mathematizing the interactions between the various microorganisms present in biological facilities such as anaerobic digestion or biological nitrogen removal processes. The model application was proved by predicting WWTP process efficiency and microorganism’s dynamics. In the future, if the analysis of microbial cluster structure in anaerobic digestion process and the study on deriving the biokinetic parameters of various microorganisms are carried out, efficiency of the more complex anaerobic digestion process and prediction of microbial dynamic variation will also be possible.

전통적으로 생물학적 하수처리, 고농도 유기성폐기물의 혐기성 소화 등의 생물학적 공정은 제어의 필요성이나 조업의 유동성이 적은 분야로 여겨져 왔으며, 설계 당시 공정 부하량 변동에 유연하게 대처하기 위해서 필요 이상의 용량으로 건설되어 왔음. 하지만 점차 복잡해지는 공정과 강화되는 법적 규제로 인해 새로운 처리 공정의 개발보다는 기존 공정의 최적화 혹은 공정 제어가 중요한 문제로 부각되고 있음. 하지만 생물 공정의 경우 화학 공정과 비교해 볼 때, 다음과 같은 어려움 즉, 군집으로 이뤄져 있는 미생물에 대한 이해 부족, 미생물의 동역학적 특성에 대한 연구 부족, 미생물 간 상호작용에 대한 영향에 대한 이해 부족, 관련 미생물 반응 모사한 수식화의 어려움 등으로 인해 공정 최적화 및 공정 제어가 어려운 실정임. 미생물 동역학 기반의 모델링은 미생물의 생장과 기질 소비에 대한 관계를 수식화함. 이러한 모델은 생물학적 공정에 대한 이해를 높이며, 설계 시 적절한 용량 산출, 최적 운전 조건 제시, 생물학적 제어 방법론을 제공할 수 있기에, 미생물의 동역학적 거동에 대한 이해를 바탕으로 한 수학적 모델 개발에 대한 연구가 각광 받고 있음. 기 수행된 모델링 연구들의 공통점은 실제 자연계 혹은 생물공정에서 일어나는 현상을 수학적으로 표현함으로써, 해당 생물 공정 시스템의 정확한 해석 및 예측에 도움을 주고자 하는 것임. 하지만 현재까지 생물공정에서 사용 중인 동역학적 모델의 경우 미생물량을 단일 변수를 사용함으로써, 다양한 미생물이 군집으로 존재하는 생물공정에서 미생물 간 상호작용을 나타내지 못하고 있음. 생태학적으로 2종 이상의 생물은 여러 상호작용을 가지며 서로의 생장에 영향을 끼침. 이에 동일 기질을 limiting nutrient 으로 하는 2종 이상의 미생물도 어떠한 형태로든 상호작용을 갖고 있을 것이며, 이를 수식화함으로써 보다 정확한 생물 공정 예측과 제어가 가능할 것으로 사료됨. 따라서 본 연구에서는 동일한 기질을 사용하는 서로 다른 미생물의 상호작용을 수식화 하며, 이를 정량적으로 검증하여 상호작용을 포함한 모델을 개발하여 생물 공정 최적화 및 예측의 기반 연구를 수행하였음. 첫번째로 실험에 활용한 미생물 종을 선정하고 해당 종을 구분하여 정량할 수 있는 시스템을 구축하는 것임. 미생물은 혐기성 소화조에서 발견되는 미생물 중 주요한 미생물로 판단되는 종으로 선정하였음. 1년간 전국 22개의 소화조의 미생물을 모니터링 하였음. 22개의 소화조의 기질은 음식물류, 하수슬러지, 가축분뇨, 음식물류 + 하수슬러지, 음식물류 + 가축분뇨로 다양한 소화조를 선정해 미생물 분석을 수행하였음. 차세대 염기서열 분석법 (Next-generation sequencing)을 통해 소화조 내 박테리아 군집 및 박테리아 종에 대한 분석을 수행하였음. 소화조 내 박테리아 군집은 기질 종류에 따라 매우 다른 군집 구조를 가지고 있었지만, 모든 샘플에서 발견된 공통종이 있었음. 공통종의 중요성에 대해서는 생태학적으로 생태계 유지에 중요한 역할, 군집 구조 형성에 역할을 하며, 생태계 내 종 다양성에 대한 지표로 활용되며, 종 간 상호작용의 중심에 있는 의미를 가지고 있음. 최근 환경 분야에서 이러한 종을 core microorganism이라 명명하고 이를 규명하기 위한 많은 연구가 진행되고 있었음. 본 연구의 1년간 88개 샘플 분석에서 발견된 공통종은 genera Clostridium, Syntrophomonas가 발견되었음. 이 중 genus Syntrophomonas는 특정 Methanogen이 있어야 생장 가능한 종이기에 본 연구에서 활용하기 적합하지 않았음. 이에, genus Clostridium 을 최종적으로 선정하였지만, 이 genus는 약 150개의 종이 존재함. Clostridium cadaveris는 이 genus의 대표종이기에 선정하였고, 이와 파트너 미생물로는 생물학적 niche (생장조건, 생장속도)가 비슷한 종으로 선정하였음. C. cadaveris와 생장조건이 동일한 종은 세개가 있었으며, 이는 Clostridium acetobutyliucm, Clostridium sporogenes, Clostridium spenoides임. 생장속도를 비교하기 위해 세종의 최대비생장속도 (μm), 반포화상수 (Ks)를 도출하는 실험을 수행하였으며, C. cadaveris와 매우 유사한 생장속도를 가진 종은 C. sporogenes으로 판단되었기에, 해당 두 종을 대상으로 추후 실험을 진행함. 두 종을 각각 정량할 수 있는 시스템 구축이 반드시 필요하기에 실시간 중합효소 연쇄반응 (quantitative polymerase chain reaction)로 대상 미생물을 정확하고 빠르게 정량할 수 있는 시스템을 구축하였음. 두번째로 두 종 간 상호작용을 설명하는 새로운 모델을 개발하였음. 종 간 상호작용의 존재에 대한 증명을 먼저 실시하였음. 이를 위해 선정된 두 미생물 C. cadaveris, C. sporogenes의 회분식 모드에서 순수, 혼합배양 실험을 수행하였음. 실험은 포도당 농도 5.0 g/L로 수행하였으며, 초기 미생물 농도는 OD < 0.01 조건에서 두 종의 개체수를 동일하게 맞춰서 수행하였음. 순수배양에서 각 미생물의 기질 감소와 미생물 생장속도 패턴과 혼합배양에서 기질 감소와 미생물 생장속도 패턴을 통계적으로 비교하였음. 기질 감소 패턴은 두 종 모두 혼합배양에서 더 빨라졌으며, 미생물 생장속도는 두 종 모두 혼합배양에서 그 속도가 줄어들었음. 증명을 위해서 기질 감소는 First-order kinetic coefficient 값을 비교하였고, 미생물 생장속도는 Modified Gompertz model의 γmax 값을 비교하였음. 상호작용에 대한 영향을 입증하였고 이 후 상호작용을 설명하는 새로운 모델을 개발하기 위해 상호작용이 일어나는 원리에 대한 과학적 가설을 수립하였음. 첫번째로 종간 상호작용은 종들이 분비하는 화학적 신호 물질에 의해 이뤄지며, 이 신호 물질의 농도는 개체수와 함께 증가함. 두번째는 이러한 신호 물질의 농도는 개체수의 농도와 비선형적인 관계를 가짐. 위 두가지 가설을 포함하는 수식 형태를 다양하게 수립하였음. 혼합배양에서 얻은 실험값과 다양한 모델의 예측값을 비교하여 정확도가 가장 높은 모델을 선정하였음. 새로운 모델에 대한 평가는 R2와 Alkaike information criterion (AIC)의 값을 비교하여 R2가 가장 높고 AIC값이 가장 낮은 모델로 선정하였음. 모델 예측능이 가장 높은 모델에 대한 생물학적 의미를 부여하였음. 해당 모델의 상호작용에 대한 수학적 형태는 αXθ로써, 개체수에 α라는 계수가 곱해지면서 그 의미는 개체수의 농도와 함께 그 영향이 증가하다는 것을 의미하고 있음. 이는 상호작용을 일으키는 화학적 신호 물질이 개체수 증가와 함께 증가한다는 내용을 포함하고 있음. 두번째로 개체수에 θ라는 계수가 지수 형태로 연산 되었으며 그 의미는 개체수의 농도 증가가 그 영향에 비선형적인 영향을 준다는 것을 의미하고 있음. 이는 생물학적으로 화학적 신호 물질이 종 개체수와 선형적 관계로 증가 혹은 감소하지 않는다는 것 내용을 포함하고 있음. 세번째로 개발된 상호작용 모델을 반연속식 운전 조건에서 활용하여 그 예측능을 평가하였음. 반연속식 운전은 이전 연구의 회분식 운전과 다른 특징을 가지고 있음. 일정한 체류시간을 가지며 일정한 농도의 기질이 공급되기에 미생물은 일정한 비생장속도를 유지할 수 있으며, 이는 시스템의 정상상태를 가져옴. 새롭게 개발된 모델을 물질수지를 반영한 반연속식 운전 조건에서의 수식으로 변형하였음. 모델을 통해 각 미생물에 대한 잔여 포도당, 개체수 농도에 대한 시뮬레이션을 다양한 체류시간 조건하에서 수행하였음. 각 미생물에 대한 wash-out 발생하는 체류시간을 계산하였고, 이는 C. cadaveris, C. sporogenes에 각 6.1, 6.0h 로 계산되었음. 실험에서 적용한 체류시간은 120h으로 각 미생물이 wash-out이 일어나는 체류시간보다 긴 체류시간을 제공함으로써 체류시간의 영향을 최소화하고 종 간 상호작용의 영향을 조사함. 반연속식 운전에서 순수, 혼합 배양을 수행하였으며, 체류시간 120h 하에서 두 미생물 모두 순수배양에서 정상상태에 도달하였음. C. cadaveris는 정상상태에서 그 농도는 0.89 ± 0.02 x 1011 copies/mL 으로 유지되었고, 모델 예측값인 0.91 x 1011 copies/mL 과 큰 차이가 없었음. C. sporogenes도 정상상태에 도달하였으며, 그 농도는 0.43 x 1011 copies/mL 이고 모델 예측값인 0.45 x 1011 copies/mL 과 큰 차이 없었음. 혼합배양에서 동일 기질에 대한 경쟁이 발생하였고 그 결과 한 종만 살아남았음. 이는 생태학 이론 중 경쟁 배타 원리로 설명되고 있으며, 이를 개발한 수학적 모델로 설명하였음. 혼합배양에서 C. cadaveris는 동적인 변화 구간을 거쳐 정상상태에 도달하였으며, 정상상태에서 그 농도는 0.88 ± 0.02 x 1011 copies/mL 이며 개발된 모델의 예측값인 0.91 x 1011 copies/mL 과 큰 차이가 없었음. C. sporogenes는 경쟁에서 패배하였으며 해당 시스템에서 살아남지 못하였음. 같은 체류시간의 순수배양에선 정상상태에 도달했지만, C. cadaveris와 경쟁인 상황에서 살아남지 못하였음. C. sporogenes의 멸종되는 동적변화구간을 새로운 모델은 정확하게 예측하였음. 결론적으로 새롭게 개발된 모델은 반연속식 운전에서 미생물의 동적인 변화와 정상상태의 농도를 정확하게 예측하였음. 마지막으로 실규모의 폐수처리공정에 대하여 새로운 모델을 적용시켜 실공정의 유출수 농도를 예측함으로써 모델의 신뢰성을 높였음. 실공정의 미생물을 활용해 동일한 기질인 암모니아 300 mg N/L 조건하에서 회분식 실험을 수행하였음. 폐수처리공정에서 주로 발견되는 질산화 미생물 (AOB) 중 Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas nitrosa 두 종이 발견되었고, 개발한 모델을 적용해 두 종의 동역학계수를 도출하였음. 도출한 동역학계수를 활용해 실공정 효율을 예측하였음. 실공정은 연구실 규모 반응기와 비해 외부 환경요인에 의한 영향이 큼. 특히 유입 원물의 양과 성상 변화는 공정 효율에 큰 영향을 미치는 것으로 보고되고 있음. 유입 원물의 양과 성상 변화는 모델 시뮬레이션 결과에 직접적인 영향을 주는 조건으로 모델링에 매우 중요한 조건임. 이에, 실규모 공정 효율을 예측하기 위해서는 미생물의 동역학계수 뿐만 아니라, 해당 공정의 유입수의 농도와 유량에 대한 정보가 반드시 필요함. 본 연구에서는 폐수처리 설비 한곳을 대상으로 8주간 주 2회 샘플을 제공받아 유입수 및 유출수 내 암모니아, 미생물 개체수 농도를 모니터링 하였음. 시뮬레이션에 활용한 Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas nitrosa의 동역학계수는 설비 내 미생물로 도출한 값을 사용하였고, 유입수 내 암모니아 농도와 설비 체류시간은 폐수처리설비 조업 분석값을 활용해 모델의 유출 수 내 암모니아 값과 실측값 비교를 통해 모델의 성능 및 예측능 평가를 실시하였음. 새롭게 개발된 모델은 실규모 폐수처리설비의 잔여 암모니아농도와 우점종인 N. europaea의 동적인 변화를 정확하게 예측하였으나, 비우점종인 N. nitrosa의 동적인 변화는 예측하지 못하였음. 그 이유로는 시뮬레이션은 유입수 내 암모니아 농도, 체류시간만 변수로 가정해 수행하지만, 실규모 폐수처리설비는 이러한 변수 이외에도 유입수 특성, 암모니아 이외 영양소 또한 다양한 환경적 요인이 있기에 N. nitrosa의 정확한 예측을 하지 못하였음. 본 연구 결과는 동일한 기질을 소모하는 두 종의 미생물 사이 발생하는 상호작용을 설명하는 모델 개발을 통해 자연계에서 발생하는 이와 비슷한 상황에서 그 예측가능성을 제시하였음. 혐기소화 혹은 생물학적 질소제거 공정과 같은 생물학적 설비 내 존재하는 다양한 미생물 간의 상호작용을 수식화함으로 공정 효율 및 미생물의 동적인 변화를 좀 더 정확하게 예측하고 이해할 수 있음을 확인하였음. 미생물 다양성이 혐기소화 보다 낮은 질소처리설비에서 실공정의 잔여 암모니아 농도와 미생물의 동적인 변화 예측을 통해 해당 모델의 실공정에서 활용할 수 있는 가능성을 보여주었음. 추후, 혐기소화 공정 내 미생물 군집 구조 분석과 다양한 미생물의 동역학계수 도출 연구가 수행될 경우, 더 복잡한 혐기소화 공정의 효율 및 미생물 동적 변화 예측도 가능해질 것임.