Facile Immobilization of Enzymes Using Affinity Tag Fusion Strategy

Abstract

효소는 아미노산으로 이루어진 생물 촉매이다. 일반적으로 효소는 화학 촉매에 비해 높은 반응 특이성을 가지고 있고, 환경 친화적이기에 다양한 산업에서 활용될 수 있는 높은 가능성을 갖고 있지만, 몇가지 문제들 때문에 여전히 사용이 제한되고 있다. 그 제한 요소들로는 생산하고 정제하는데 단가가 높고, 열이나 버퍼 조건으로 인해 쉽게 활성을 잃고, 재사용이 어렵다는 것이다. 필자는 이를 위해 효소를 고정화하는 방법을 선택하였다. 구체적으로, 본 학위 논문에서는 분자생명공학기법을 통해 효소의 특성에 따른 적절한 친화성 태그를 융합하고, 이 친화성 태그와 지지체 간의 상호작용을 통해 효소를 손쉽게 고정화하는 기술에 관하여 연구하였다. 실리카에 매우 강력하게 흡착한다고 (K_d=~0.5 nM) 알려진 Si-tag의 일부를 L2NC로 제작하고, 이 L2NC를 탄산무수화 효소 (hmCA)에 융합하여 hmCA-L2NC를 제작하였다. 이 융합 단백질은 대장균에서 수용성으로 발현이 잘 되었고 정제된 단백질은 규조토에 고정이 잘 되었다. 또한, 세포 파쇄액으로부터의 직접적인 고정화가 가능해 정제와 고정화가 동시에 가능함을 확인했다. 흡착 실험을 진행했을 때, 1 g의 규조토에 10 mg 보다 많은 단백질을 흡착할 경우 규조토가 포화되었다. 또한, 고정화된 효소는 4회 재사용을 해도 초기 활성의 약 93%를 유지하는 높은 재사용성을 보였고, 섭씨 60도에서 반감기가 최대 107 시간이었는데, 이는 고정되지 않은 효소보다 약 37배 높은 수치로 고정화는 열안정성을 매우 크게 증가시켰다. 이러한 장점들은 높은 온도의 배가스에서 이산화탄소를 저감하는 기술에 탄산무수화 효소의 사용이 가능하도록 할 것이다. 또한, CNK로부터 유래한 타이로시네이즈에 셀룰로오스 흡착 단백질을 융합하여 mTyr_CNK-CBM를 만들었다. 융합 단백질은 고정되지 않았을 때 버섯 유래 타이로시네이즈에 비해 활성이 높았고, 셀룰로오스 파우더에 성공적으로 흡착함을 확인하였다. 고정화된 타이로시네이즈는 다음과 같은 많은 장점이 있었다. 먼저, 세포 파쇄액에서 셀룰로오스에 직접적인 고정이 가능해 정제와 고정화가 한번에 처리가 가능했다. 또한, 반응 용액에 6시간 동안 교반시켜주어도 단백질이 거의 탈착되지 않음을 확인하였다. 따라서, 홍합접착 단백질의 DOPA 수정 후에 원심분리만을 이용하여 손쉽게 타이로시네이즈를 반응 용액에서 제거할 수 있게 되었다. 또한, 고정되었을 때도 고정되지 않은 버섯 유래 타이로시네이즈보다 활성이 높았으며, 최소 한번 이상의 재활용이 가능했고 영하 20도에서 저장성이 뛰어남을 확인하였다. 이러한 장점들은 mTyr_CNK-CBM가 상업적으로 판매되는 버섯 유래 타이로시네이즈를 대체할 수 있다는 가능성을 보여준다. 본 학위 논문 연구에서는 친화성 태그를 효소에 융합하고 고정화하여 효소의 기존 문제점을 해결했다. 특히, 흡착 방법은 고정화와 정제가 한번에 가능하여 다른 고정화 방법보다 간편하고 효율적이며 경제적임을 확인하였다. 또한, 고정화된 효소는 효소의 활성은 유지하면서 높은 열안전성 또는 저장성, 그리고 재사용성을 보였다. 이렇게 친화성 태그는 장점이 많지만, 친화성 태그를 이용한 고정화를 하기 위해서는 먼저, 친화성 태그와 효소의 최적 조건이 잘 맞는지 확인해야 한다. 이것이 잘 맞지 않는다면, 정제가 잘 되지 않거나, 효소가 쉽게 손실될 수 있고, 혹은 활성이 금방 떨어질 수 있다. 하지만, 이 조건을 잘 맞추기만 한다면, 효소에 친화성 태그를 융합하여 지지체에 고정하는 방법이 대규모 산업 분야에서 사용될 수 있을 것이다.

Recently, the usage of enzymes has increased dramatically. It is not only limited for food ingredients, but also used in production of bio-fuels or drugs. The reasons for rising enzyme usage are that enzymes are more specific than chemical catalysts and they are eco-friendly material. However, use of enzymes has several limitations. First, the production cost of enzyme is high and the processes are intricate. Besides, enzymes might lose their activity as soon as they mix with reaction buffer. In addition, if the enzymes are not removed properly, undesired reactions might take place too much. Thus, immobilization is a way to solve these problems. Immobilization is categorized into physical absorption, encapsulation and crosslinking. Among them, physical absorption is the simpler method than other immobilization techniques. Additionally, physical absorption of affinity tag is so specific that it could utilize one-step immobilization that could minimize purification cost. We fused silica tag to carbonic anhydrase and cellulose affinity tag to tyrosinase, respectively. Carbonic anhydrase adsorbed well onto diatomite that mainly consists of silica and one-step immobilization onto diatomite was possible. The carbonic anhydrase catalysts exhibited great reusability and the thermal stability of immobilized enzyme improved dramatically compared to that of free enzyme. The immobilized carbonic anhydrase enhanced the half-life (t_(1⁄2)) by approximately up to ~37-fold at 60 ºC compared with free enzyme. Especially, a positive correlation between the half-life of the fused enzyme and the loading amount appeared to exist. Tyrosinase fused with cellulose affinity tag also adsorbed onto cellulose from cell lysate by one-step immobilization. Immobilized tyrosinase retained DOPA modification activity and the immobilized preparation exhibited better activity that of free mushroom tyrosinase which are commonly used. Moreover, we could not observe desorption of tyrosinase from cellulose in reaction buffer. Additionally, we verified reuse of the catalyst was possible and immobilized tyrosinase stored in -20 ºC for 14 days retained about 86% of initial activity. These results demonstrated that the affinity tag fusion strategy has high potential for facile and robust immobilization of enzymes for industrial applications.