공변화하는 NP와 NA 단백질 조합에 의한 인플루엔자 바이러스 병원성 변화에 대한 연구

Abstract

인플루엔자 A 바이러스는 자신의 유전체의 항원대변이 (antigenic shift)와 항원소변이 (antigenic drift)를 통해 자신의 복제 및 항바이러스 반응에 대한 저항성을 변화시킨다. 인플루엔자 바이러스의 유전적 변이에 의해 1918년, 1968년, 그리고 2009년에 대유행 인플루엔자를 유발하였으며, 많은 연구들은 이러한 대유행 인플루엔자의 강한 병원성의 원인을 바이러스 단백질 분석을 통해 찾고자 하였다. 다수의 연구는 인플루엔자 바이러스 단일 단백질의 특정 잔기 돌연변이가 바이러스의 복제 또는 숙주의 면역 반응을 조절 하는 것이 연구 되어 왔다. 하지만, 인플루엔자 바이러스는 11개의 바이러스 단백질로 이루어져있으며, 바이러스 복제를 위해 다수 단백질 간의 네트워크가 형성되어 다유전적(multigenic)의 특징을 보여준다. 인플루엔자 바이러스의 병원성에 대한 다유전적인 효과를 알아보기 위해, 기능적으로 연관된 물질들은 하나의 물질 변화에 의해 다른 물질도 변화한다는 공변화 컨셉을 이용하였다. 2009년 H1N1 인플루엔자 A 바이러스의 병원성에 관여하는 유전적인 특징을 찾기 위해, 417개의 2009년 H1N1 인플루엔자 A 바이러스 스트레인의 유전정보를 이용하여, 10개의 바이러스 단백질 간의 공변화율을 허계연 박사의 도움으로 측정하였다. 45개의 조합 중 NP와 NA 단백질 조합이 가장 높은 공변화 값을 측정 되었으며, 각각 NP와 NA에 특이적인 아미노산 치환이 이루어져 있었다. NP와 NA 단백질에 특이적 아미노산 잔기(NPV100I, NAD248N)를 갖게끔 재조합 인플루엔자 A 바이러스를 제작을 하여, 세포독성 및 병원성을 확인하였다. 그 결과 비교군으로 사용한 각 NP와 NA 단일 단백질에 대한 특이적 아미노산 잔기를 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스에 비해 강한 세포 사멸 능력 및 싸이토카인 생산 능력을 보여주었으며, 동물모델에서 동물의 생존률을 급격히 감소시키는 것을 확인함으로써, NP와 NA 조합을 갖는 재조합 인플루엔자 A 바이러스는 강한 병원성을 찾는 것을 확인하였다. NPV100I와 NAD248N 조합을 갖는 재조합 인플루엔자 A 바이러스의 강한 병원성에 대한 메커니즘을 확인하기 위해, 단백질 간이 결합과 각 단백질의 기능 변화를 확인하였다. NP와 NA의 단백질 간 결합은 없었지만, NP의 RNA 결합 능력은 V00I 돌연변이에 의해 증가하였으며, NAD248N이 같이 존재하는 조건에서는 더욱더 증가하였다. 한편 NA는 세포막에 존재하는 지질 뗏목 (lipid raft)로의 이동이 D248N 돌연변이에 의해 증가하였으며, NPV100I 존재에 의해 지질 뗏목으로 이동하는 NA양은 더욱 더 증가하였다. 지질 뗏목으로 가는 NA의 양을 조절에 의해, NP의 RNA 결합 능력이 변화 하였다. 이는 새롭게 만들어지는 인플루엔자 A 바이러스의 Budding위해 간접적으로 NP의 RNA 결합 능력이 영향을 주고 있다. 이를 통해, 본 연구는 강한 병원성을 보였던 2009 H1N1 인플루엔자 바이러스의 유전정보 분석을 통해 획득한 공변화하는 NPV100I 와 NAD248N 단백질 조합이 인플루엔자 바이러스의 조립과 분비 (assembly and release) 증대를 유발해 바이러스 병원성 증가 시킨다는 모델을 제시하고 있다.

The influenza A virus changed the ability of their replication and anti-host defense system by alteration of their genomes through antigenic shift and antigenic drift. In 1918, 1968 and 2009, the influenza viral genetic variation caused a strong influenza viral pathogenicity also known as pandemic outbreak. Many studies have tried to explain where strong viral pathogenicity comes from. Based on the analysis of single viral protein mutation, scientists found the specific residues at viral proteins which regulated viral replication or host immune response. However, the influenza A viruses have 11 viral proteins, and multiple viral proteins work together for their viral replication. Therefore, it was hard to explain the viral pathogenicity through single viral protein mutation. To approach the new insight about multi-genic effect on viral pathogenicity, co-variation (co-evolution) concepts that the change in a biological object triggered by the change of a functionally related object, was adopted. To identify pairs of genetic traits that contributed to the pathogenicity of the 2009 H1N1 influenza A virus that genome sequences are available, the covariations of 10 viral proteins using sequence information obtained from 417 isolates during the 2009 pandemic were measured. Among 45 combinations, the NP and NA pair showed an exceptionally high covariance value. Specific amino acid substitutions that frequently co-occurred in the NP and NA pairs were mapped, and recombinant WSN influenza A viruses with the corresponding substitutions at each NP and NA position were generated. In contrast to individual NP or NA recombinant viruses (NPV100I NAWSN or NPWSN NAD248N), NPV100I NAD248N WSN viruses with co-varying substitutions were highly pathogenic. The recombinant NPV100I NAD248N WSN virus was lethal for BALB/c mice and was accompanied by increased viral production, cytokine and chemokine expression, and cell death. Physical interaction between NPV100I and NAD248N was not observed, and the viral RdRP activity was not altered by these substitutions. In contrast, the RNA-binding ability of the NP protein was increased by the V to I substitution at 100th residue, which was further strengthened by co-expression with the NAD248N protein. The NAD248N protein, meanwhile, was recruited more frequently within the lipid raft compartment, which indirectly affected the RNA-binding ability of the NP protein as well as viral release. Together, these data indicate that the co-varying NPV100I and NAD248N pair functions together to synergistically augment viral assembly and release, which may explain the pathogenicity of the 2009 pandemic H1N1 influenza A virus