Precise flux redistribution to glyoxylate shunt for efficient production of value-added chemicals

Abstract

Metabolic engineering is redesigning the cellular metabolism for various purposes and has made a significant contribution to the development of biotechnology. For chemical production, several strategies involving overexpression of the product synthetic pathway, removal of the competing pathway, and expression optimization of a metabolic key node have been a powerful solutions. Apart from the technical issues, the most important prerequisite for efficient engineering is an in-depth understanding of cellular metabolism. In this study, the characteristics of glyoxylate shunt were analyzed and exploited for chemical production in accordance with the principle of metabolic engineering. The glyoxylate shunt is a branch of the TCA cycle, and functionally it can convert the TCA intermediates with relatively simple enzymatic steps rather than the TCA cycle. In addition, an anaplerotic reaction is involved that allows a cell to grow with small carbon compounds. Despite such characteristics, it cannot be actively utilized in metabolic engineering and its utilization strategy was also limited. In this regard, the novel strategy to precisely regulate the glyoxylate shunt was designed and applied to the production of various chemicals. The followings are summarized contents in this study. First, the efficient conversion of acetate into valuable chemicals, itaconate and L-tyrosine, were described. Acetate is the promising carbon source in that it can be obtained much abundantly and cheaply from various sources, however, its growth inhibition issues have limited its applications for chemical production. In this study, such issues have been solved through the metabolic engineering-based strategies including screening of acetate-tolerant Escherichia coli and optimization of glyoxylate shunt pathway. The efficient production of itaconate, which can be produced from TCA intermediate was demonstrated. Furthermore, the strategies were effectively applied to the production of L-tyrosine from a glycolytic node, showing that the novel strategy designed in this study can be widely applied to the production of various chemicals from acetate. Second, the novel strategy was applied to the production of 5-aminolevulinic acid (ALA) from glucose. The glyoxylate shunt was employed for TCA conversion instead of the native TCA cycle for precise flux redistribution, and it allowed significantly enhanced ALA production with robust cell growth. This achievement demonstrates that the strategy is not limited to the use of small carbon compounds such as acetate but can be used more broadly, showing enough potential of the strategy.

바이오 리파이너리는 다양한 바이오매스로부터 유용한 화합물이나 에너지를 만드는 공정이다. 석유 자원의 고갈이나 가격 변동과 같은 문제로 바이오 리파이너리는 지속적으로 관심 받아 왔으며, 앞으로 보다 비중 있는 역할을 차지하게 될 것이다. 바이오 리파이너리는 대게 미생물의 발효를 이용하는데, 자연에 존재하는 미생물의 물질 대사는 자신들의 생장과 재생산에 초점이 맞춰져 있어 대부분의 경우 미생물의 물질 대사를 원하는 목적에 맞게끔 재설계하는 일이 필수적이다. 해당 역할을 수행하는 학문 분야가 대사 공학이며, 이러한 이유로 바이오 리파이너리 산업은 대사 공학의 발전과 함께 근간을 다져왔다. 대사 공학에서 특정 화합물 생산을 위해서는 화합물 생산 회로를 과발현시키거나 부산물 생산 회로를 포함한 불필요한 대사 회로를 제거시키는 방법을 통해 원하는 대사 흐름을 증폭시키는 전략이 사용될 수 있다. 불필요한 대사 회로가 세포의 성장과 같은 필수적인 대사 회로와 연관되어 있을 경우에는 유전자의 단순 발현이나 제거가 아닌 해당 유전자들의 발현 최적화를 통해 원하는 대사 흐름을 보다 향상시킬 수 있다. 구체적으로 지나치게 많은 대사 흐름이 화합물 생산으로 진행될 경우에는 세포당 생산성은 어느 정도 향상될 수 있지만 세포 성장이 심하게 저해된다는 점에서 전체 생산성이 높게 유지될 수 없기에 해당 노드 유전자들을 정교하게 조절하고 최적화하는 일이 특히나 중요하게 여겨진다. 대사 공학에서 이러한 전략들이 효과적으로 적용되기 위해서 무엇보다도 중요한 것은 먼저 대사 회로를 깊게 이해하는 것이다. 본 연구에서는 이러한 대사 공학의 기본 원리에 입각하여, 먼저 글리옥실산 회로의 특성을 이해하고 다양한 화합물 생산에 적용하고자 했다. 글리옥실산 회로는 TCA 회로의 곁가지 회로로 대장균, 식물, 곰팡이에 존재한다. 이는 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase)와 말산 신타아제(malate synthase) 두 효소로 구성되는데, 이소시트레이트 리아제는 이소시트레이트를 숙신산(succinate)과 글리옥실산(glyoxylate)로 전환시키며, 말산 신타아제는 글리옥실산을 아세틸-조효소(acetyl-CoA)와 중합하여 최종적으로 말산을 만든다. 이를 통해 최종적으로 이소시트레이트가 숙신산과 말산으로 전환되게 되는 것이며, 이 경우 TCA 회로와는 다르게 탄소 유실이 발생되지 않는다. 더불어, 아세틸-조효소의 중합 반응을 포함하고 있기 때문에 대체 보충 반응(anaplerotic reaction)을 수행한다는 특성을 가진다. 특히, 해당 반응은 아세트산과 같은 작은 유기 화합물을 대사하는 데 있어서는 유일한 보충 반응을 수행하게 되어 굉장히 중요한 역할을 수행한다. 이러한 특성에도 불구하고, 글리옥실산 회로의 활용은 글리옥실산이 알려진 수십년 동안 굉장히 제한적으로 이루어져 왔다. 글리옥실산 회로 유전자들의 전사 억제 인자인 iclR 유전자의 제거를 통해 손쉽게 글리옥실산 회로를 증폭시킬 수 있다고 알려졌고, 이를 활용한 단순 회로 증폭만이 화합물 생산에 적용되곤 했는데, 그 역시 숙신산이나 퓨마르산(fumaric acid)과 같은 TCA 회로와 직접적인 연관을 갖는 화합물들에 국한되었다. 이는 사실 해당 전략을 통해서는 글리옥실산 회로를 정교하게 조절할 수 없기 때문이며 본 연구에서는 새로운 전략을 통해 다양한 화합물 생산에 효율적으로 글리옥실산 회로를 활용해보고자 하였다. 폭넓은 활용을 위해서는 글리옥실산 회로를 정교하게 조절하는 것이 필수적이라 판단하였으며, 이를 위해서는 글리옥실산 회로의 첫 반응을 매개하는 이소시트레이트 리아제의 발현을 정교하게 조절하고자 했다. 이는 단순히 해당 효소가 첫 반응을 매개하는 것 이외에도 나머지 반응에 비해 열역학적으로 비호의적이라고 알려져 있기 때문이다. 해당 유전자의 정밀 발현 조절은 합성생물학적 도구를 활용하여 전사 레벨에서 진행되었고 실제로 글리옥실산 회로의 전반적인 흐름이 해당 효소 발현에 따라 효율적으로 조절되는 것을 확인할 수 있었으며, 다양한 화합물 생산에 직접 적용해보고자 했다. 먼저, 차세대 탄소원인 아세트산을 활용한 화합물 생산에 적용해보고자 했다. 아세트산은 굉장히 풍부하고 값싸게 얻어질 수 있는 탄소원으로 경제성 분야에서 특히 각광받는 차세대 탄소원이나 미생물의 성장을 저해한다는 점에 그 활용이 제한되어 왔다. 본 연구에서는 글리옥실산 회로의 정교한 조절 및 다양한 대사 흐름 최적화를 통해 아세트산의 대사능을 큰 폭으로 향상시킬 수 있었으며, 최종적으로 고부가가치물질인 이타콘산과 타이로신 생산성을 각각 크게 향상시킬 수 있었다. 이 과정에서 아세트산의 잠재적 활용 가능성을 돋보일 수 있었으며, 특히 타이로신의 경우에는 TCA 회로가 아닌 해당 회로(glycolytic pathway)의 중간체로부터 파생되어 생산되는 화합물이라는 점에서 본 연구의 전략이 폭 넓게 활용될 수 있음을 보였다. 더불어, 본 연구의 전략을 글루코오스(glucose)로부터 5-아미노레불린산(5-aminoluvulinic acid) 생산에도 적용시켜 보고자 했다. 구체적으로, 5-아미노레불린산 생산 과정에서 생기는 TCA 불균형을 글리옥실산의 도입 및 최적화를 통해 해결하고자 하였으며, 이를 통해 세포 성장과 5-아미노레불린산 생산이 큰 폭으로 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 글리옥실산 회로의 활용이 아세트산과 같은 작은 유기산의 대사뿐 아니라 다양한 탄소원으로부터의 화합물 생산을 위한 정교한 탄소 흐름 재분배에도 적용될 수 있음을 보였다.