Development of New Platforms for Proteomics Utilizing Supramolecular Latching System with Ultrastable Synthetic Binding Pairs

Abstract

This thesis describes the development of supramolecular platforms for proteomics based on host-guest complexes of cucurbit[7]uril with a high binding affinity (Ka = 1012-1017 M-1), specificity and bio-orthogonality as a “supramolecular latching system”. The platforms have been successfully exploited as alternatives to conventional streptavidin-biotin (SA-BT) based methods with improved bio-orthogonality in protein imaging and detection. In addition, the combination of the aforementioned supramolecular platforms with SA-BT renders an emergent application in chemical proteomics as a spatially specific protein isolation method. Chapter 1 briefly introduces the current status of proteomics and chemical proteomics. The naturally derived protein-ligand binding pair, streptavidin-biotin (SA-BT), is described, followed by the host-guest complexation of cucurbiturils (CBs), especially that of CB[7]. Additionally, the advantages of a supramolecular latching system over naturally derived protein-ligand binding pair, in proteomics, is presented. Chapter 2 describes a fluorescence imaging platform using cyanine 3 conjugated CB[7] (Cy3-CB[7]). The platform was successfully utilized to image various target proteins including: 1) membrane proteins with FcA tags in living cells, 2) spatially restricted proteins with AdA tags in mitochondria and nucleus in fixed cells, 3) a target-specific protein labeled with AdA by a self-labeling protein tag, and 4) proteins on the skin of a worm labeled with AdA. In addition, the bio-orthogonality of the platform was demonstrated by comparing the fluorescence imaging with the dye-SA and BT pair. Chapter 3 presents a protein detection platform utilizing CB[7]-conjugated horseradish peroxidase (CB[7]-HRP). The platform was manifested on target proteins labeled with AdA by biochemical methods including: 1) Sortagging of LPETG peptide-containing protein by Sortase A, 2) self-labeling with SNAP-tag, and 3) spatial labeling with enhanced engineered ascorbate peroxidase (APEX2). The labeled proteins were examined by western blot using CB[7]-HRP. The bio-orthogonality of the protein detection platform was demonstrated by comparing the western blots obtained with CB[7]-HRP and SA-HRP. Chapter 4 delineates a spatially specific identification platform for membrane proteins at the contact site (junction) between mitochondria (Mito) and endoplasmic reticulum (ER). The mutual orthogonality of two labeling methods (APEX2 and promiscuous biotin ligase, pBirA) and isolation tools (CB[7]-AdA and SA-BT pairs) enables the spatial identification of junction proteins. The ER-transmembrane proteins at the junction of ER-Mito were thereby isolated and identified by LC-MS/MS. We envisage that this new platform can be further improved by optimization and then extended to the identification of other junction proteomes at the sub-cellular level.

단백질은 하나의 유전자로부터 여러 종류가 발현될 수 있으며, 만들어진 단백질들은 여러 생화학적 변형에 의해 다양성을 가지며, 서로 다른 기작에 참여하거나, 단백질 복합체를 형성하여 특정 기능을 가지게 된다. 이러한 단백질에 대해 연구하는 학문은 단백질체학(Proteomics)라 불리며, 유전자로부터 만들어지는 단백질들에 대한 총체적인 연구들을 포함한다. 특히나, 단백질의 발현, 기능, 구조, 변형 및 다른 단백질과의 연관성 등에 대한 연구가 대표적이다. 단백질을 연구하는 다양한 방법 중 화학적인 방법들을 사용하여 이들을 연구하는 방법을 화학단백질체학(Chemical Proteomics)이라 부른다. 이 방법들은 기존 생물학적인 방법들을 사용한 단백질체학에서 발굴할 수 없었던 사각에 있던 단백질들을 발굴하거나, 효과적으로 분석할 수 있는 생화학적 방법들을 개발하여 더욱 폭넓은 단백질에 대한 연구를 가능케 해왔다. 특히나, 단백질을 형광이미징을 통해 관찰하거나, 생화학적인 기법을 이용해 검출하고, 선택적으로 분리하여 분석할 수 있는 등의 방법들은 단백질 연구 분야의 성장에 크게 기여하고 있다. 화학단백질체학에서 자주 활용되는 재료 물질로 자연에서 유래한 결합 쌍인 스트렙타비딘 단백질과 바이오틴이 있다. 이 결합 쌍은 단백질-리간드 결합 쌍이며, 강한 결합력(Ka = 1012 ~ 1015 M-1), 선택적이고 안정한 결합을 형성하여 생물학적 분자들을 서로 연결하는 분자적 가교로 사용되거나, 선택성을 기반으로 한 단백질의 검출 및 분리 등에 활용되고 있다. 이들의 결합 특성은 항원-항체의 결합력(Ka = 106 ~ 109 M-1) 보다 훨씬 높으며 선택적이기에 매우 다양한 분야에서 활용도가 높다. 하지만 이들 결합 쌍은 몇 가지 단점이 있다. 너무 안정한 결합이 형성되어 단백질의 구조를 무너뜨려야 결합을 해체할 수 있어 가혹한 조건에서 실험을 진행해야 하며, 단백질이라 열과 유기용매에 대한 안정성이 낮다. 단백질 기반의 결합 쌍이라, 유기분자들에 비해 크기가 큰 편이며, 무엇 보다도 생체 신진대사에 관여하는 바이오틴이 다양한 단백질에 화학적으로 접합되어 있어 결합에 간섭하며 이는 부정확한 분석 결과의 원인이 된다. 본 연구실에서는 이 단백질-리간드 결합 쌍의 장점을 가지며, 단점을 극복하는 방법으로 합성으로 만들어진 유기물질 기반의 초분자 결합 쌍을 고안하였다. 쿠커비투릴(Cucurbiturils, CB)은 글라이코우릴과 포름알데하이드의 산 촉매 축합 중합반응으로 합성되는 거대고리분자 화합물로 포함된 글라이코우릴의 개수에 따라서 CB[n] (n=5, 6, 7, 8, 10)등으로 구분된다. 그 중에서도 CB[7]의 경우 비대칭적인 구조를 가져 다른 CB들에 비해 상대적으로 수용성이며, 위 아래 카보닐기와 내부 소수성 동공이 있어서 암모늄 작용기를 가지며, 소수성인 물질들과 강력한 전하-쌍극자 상호작용과 소수성 상호작용을 기반으로 한 주인-손님 상호작용이 가능하며, 비공유결합을 기반으로 형성된 초분자 결합체를 형성할 수 있다. 특히, 손님 분자로 사용되는 페로센 암모늄, 아다만텐 암모늄의 경우 CB[7]과 매우 강한 결합력(Ka = 1012 ~ 1017 M-1)을 갖는 결합체를 선택적으로 형성하며, 합성된 물질이라 열과 화학물질에 대한 안정성이 뛰어나다. 무엇보다도 생체에서 유래한 물질들과의 상호작용이 거의 없으며, 생체 내 바이오틴과 서로 간섭하지 않는다는 특징이 있다. 손님분자의 종류에 따라 생기는 결합력의 차이를 활용하면, 결합을 조절할 수 있다. 예를 들어 결합력 하나의 암모늄 작용기를 가지는 페로센의 경우 약 1012 M-1의 결합력을 가지며, CB[7]과 초분자 결합체를 형성한다. 이 후 두개의 암모늄 작용기를 가지는 페로센을 처리해주면 기존의 초분자 결합체는 손님분자가 치환되어 더욱 강력한 결합력(Ka = 1015 M-1)을 가지는 결합체가 형성된다. 이는 CB[7] 기반의 초분자 결합체의 특징이다. 이 결합체들을 활용하면 기존의 스트렙다비딘-바이오틴 결합체와 비슷한 특징을 가지며, 단점이 보완된 재료로 활용이 가능할 것으로 생각하여 다양한 단백질 분석 플랫폼을 개발하는 연구를 진행하였다. Chapter 2 에서는 CB[7]에 아민 작용기를 도입하였으며, 이를 사이아닌 3 (Cyanine 3) 형광물질에 도입하여 Cy3-CB[7]을 만들었으며 이를 활용해 초분자체를 기반으로 한 단백질 형광 이미징 플랫폼을 개발하였다. 스트렙타비딘-바이오틴 결합 쌍을 이용한 단백질 형광 이미징의 경우 보고자 하는 단백질의 발현량이 적은 경우, 생체 내 바이오틴이 접합된 단백질에 의한 간섭 때문에 부정확한 이미징 결과를 얻게 된다. 하지만 CB[7]과 페로센/아다만텐을 활용하면 이러한 간섭없이 이미징이 가능하다. 다양한 생화학적 단백질 표지 방법들 (화학 반응, 효소 반응, 단백질 자가 반응 등)을 활용하여 세포막 단백질, 세포 내 소기관 단백질들을 선택적으로 페로센/아다만텐 유도체로 표지하였으며, 이들을 선택적으로 Cy3-CB[7]을 이용해 형광 이미징을 진행하였으며, 생체 내 물질들과 상호작용이 없어서, 매우 정확한 단백질 분석이 가능함을 확인하였다. 본 연구를 통해 초분자를 이용한 단백질 분석 방법이 기존의 단백질-리간드 결합 쌍을 이용한 방법과 비슷하거나 더 효과적인 이미징 방법으로 활용될 가능성을 확인하였다. Chapter 3에서는 아민 작용기를 가지는 CB[7]을 겨자무과산화효소 (Horseradish Peroxidase, HRP)에 화학적으로 접합하여, 주인분자-효소 하이브리드 물질 (CB[7]-HRP)을 개발하였으며, 이를 이용하여 웨스턴 블롯의 형태로 아다만텐이 표지된 단백질들을 선택적으로 검출할 수 있는 단백질 분석 플랫폼으로 활용하였다. 마찬가지로, 다양한 생화학적 방법들을 활용하여 박테리아나 포유류 세포에서 발현된 단백질을 선택적으로 아다만텐을 표지하였고, 세포 내 소기관 단백질인 소포체, 핵, 미토콘드리아 등의 단백질들을 APEX (Enhanced Engineered Ascorbate Peroxidase)라고 불리는 효소를 이용하여 공간-선택적으로 아다만텐을 도입하였으며 이들을 CB[7]-HRP를 이용해 성공적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. Chapter 4에서는 세포 내 소기관 접점에 존재하는 막 단백질들을 생화학적 방법으로 선택적 표지를 진행하였고, 표지된 단백질들을 CB[7]이 도입된 마이크로 크기의 고분자 비드와 스트렙타비딘이 도입된 비드를 함께 활용하여, 표지된 단백질들의 선택적 분리 및 질량분석기를 이용한 분석에 활용하였다. 세포 내 그물망 형태의 구조를 가지는 소포체와 이들과 상호작용하는 접점이 가장 많은 미토콘드리아는 서로 상호작용하며, 다양한 세포 기작에 참여하는 것으로 알려졌으나, 접점에 존재하는 단백질들을 선택적으로 분리하고 분석하는 것엔 기술적 한계가 있다. 본 연구에서는 미토콘드리아와 소포체의 막 단백질들을 각각 바이오틴 연결효소(Promiscuous Biotin Ligase, pBirA)와 APEX2를 이용하여 바이오틴과 아다만텐으로 표지하여, 접점에서는 두 화학물질이 동시에 표지하였다. 세포로부터 얻어진 단백질 용액에 CB[7] 비드와 스트렙타비딘 비드를 차례대로 사용하면 두 화학물질이 모두 표지된 단백질들만 선택적으로 분리할 수 있으며, 이들을 질량분석기를 이용하였다. 본 연구를 통해 선택적이고 강한 결합력을 가지는 CB[7] 기반의 초분자 결합체를 이용하여 다양한 단백질을 선택적으로 표지하고, 이들을 분리 및 분석하는 방법들을 개발하였으며, 전통적으로 사용하던 방법과 상호 보완적으로 함께 활용할 수 있음을 성공적으로 증명하였다. 이는 초분자 화학 기반의 새로운 단백질 분석을 위한 플랫폼으로 활용 가능성이 뛰어나며, 앞으로의 연구에 적극 활용될 것으로 기대된다.