Improvement of the carbon yield by harnessing heterotrophic CO2 fixation under the aerobic condition in Escherichia coli

Abstract

Because of substantial increase in the atmospheric CO2 level caused by massive use of fossil fuel, there has been several attempts to decrease the emitted amount of the CO2. Microorganisms based biorefinery using biomass has been used to make several chemicals with contributing to carbon neutral environment. However, in the process of biofermentation, substantial amount of CO2 is emitted which limits its economic competitiveness and damages its eco-friendly image. In this study, blocking carbon loss steps in the central carbon metabolism of Escherichia coli and inducing carbon fixation with oxidization of carbon source by rewiring the metabolic pathways were conducted to improve the carbon yield during biochemical -IIfermentation. At first, knocking genes which express CO2 releasing enzymes inside the central carbon metabolism was followed by enabling co-consumption of glucose and acetate along with inactivating phosphotransferase system (PTS)-involved carbon catabolite repression (CCR). Through these steps of engineering, it was targeted to reduce the released amount of the CO2 during cellular catabolism. Also, the carbon flux derived from the glucose was blocked to the acetyl-CoA and rearranged to the oxaloacetate with making the flux pass through the anaplerotic CO2 fixation reaction. Instead of the glucose-derived flux, acetyl-CoA was synthesized form the acetate and citrate, the target chemical in this study, was made based on the two-independently working metabolic pathways. Finally, by overexpression of the anaplerotic CO2 fixation reaction enzyme, PEP carboxylase (ppc), and subsequent reaction required for the target chemical production, additional engineering was conducted to amplify and effectively induce the carbon flux bound for the carbon fixation steps. These series of engineering made the HCF1 strain emit less CO2 with substantial increase in citrate production, a target chemical in this study. (7.86 fold higher than wild type one in yield, g/g, W : 0.039, HCF1 : 0.306) Inducing effective CO2 assimilation as well as preventing decarboxylation steps in the central carbon metabolism could support economic feasibility of the biorefinery to make the carbon flux more toward the target chemicals.

화석연료의 사용량이 증가함에 따라 대기중에 있는 이산화탄소의 농도가 많이 증가하게 되었고, 이를 줄이기 위한 다양한 시도가 있어왔습니다. 미생물 기반의 바이오리파이너리는 바이오매스를 이용해서 여러가지 화학물질을 만들어 냄으로써 탄소중립화 환경에 기여를 해오고 있습니다. 그러나 바이오발효의 과정 속에서, 상당량의 이산화탄소가 배출이 되고 이것은 바이오리파이너리의 가격경쟁력을 제한하고, 바이오리파이너리의 친환경적 이미지에 타격을 줍니다. 이번 연구에서는, 화학물질의 생화학적 생산과정에서 탄소 수율을 개선하기 위해서 대장균의 중심 탄소 대사 (Central carbon metabolism)에서 이산화탄소가 배출 되는 과정들을 막고 대사 경로들을 재조정하여서 탄소원의 산화와 함께 이산화탄소 고정을 유도하고자 하였습니다. 먼저, 중심 탄소 대사 내에 존재 하는 이산화탄소 배출 과정을 담당하는 효소를 발현하는 유전자들을 제거하고 탄소 이화 작용 산물 억제 (Carbon catabolite repression, CCR)과 관련 있는 포스포트랜스퍼라제시스템 (Phosphotransferase system, PTS)을 비활성화 시켜서 포도당과 아세트산의 동시 대사가 가능하게 하였습니다. 일련의 엔지니어링 단계들은 세포의 이화작용 동안 나오는 이산화탄소의 양을 줄이고자 하였습니다. 또한 포도당에서 유래된 탄소 흐름 (Carbon flux)을 아세틸 조효소 A로 가는 것을 막고, 이산화탄소 고정이 일어나는 보충대사 -54- 반응을 통과하여 옥살아세트산으로 가는 쪽으로 흐름을 재조정하였습니다. 그리하여 포도당 유래의 탄소 흐름 대신에, 아세트산에서 아세틸 조효소 A가 합성되게 하였고, 목표물질인 시트르산은 독립적으로 운영되는 2가지의 대사경로를 바탕으로 만들어졌습니다. 마지막으로 보충대사 반응 중 하나인 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소 (PEP carboxylase)와 시트르산 합성효소 (citrate synthase)을 과발현시켜서 탄소 고정 반응으로 가는 탄소흐름을 효과적으로 유도하고 증폭하고자 하였습니다. 일련의 과정을 통해 만들어진 HCF1 균주는 야생 균주 보다 이산화탄소 배출량은 수율 기준으로 약 41.6% 수준까지 감소하였고 (CO2 g/g, W : 0.830, HCF1 : 0.345), 시트르산 생산 수율도 야생 균주보다 7.86배 정도 증가 하였습니다. (Citrate g/g, W : 0.039, HCF1 : 0.306) 중심 탄소 대사에서 탈탄산 반응을 막는 것 뿐만 아니라 효과적인 이산화탄소 동화 반응을 유도하여 목표 화학물질로 가는 탄소 흐름 량을 더 늘려서 바이오리파이너리의 경제성을 높이고자 하였습니다.