Modulation of Protein-Protein Interactions: Direct Inhibition and Targeted Protein Degradation

Abstract

인체 내 단백질의 기능은 단백질 간 상호작용에 의해서 매개되고 그 때문에 단백질 간 상호작용을 조절하기 위한 전략의 개발은 화학 생물학과 약물 개발 분야에서 매우 중요한 목표이다. 현재 이러한 단백질의 기능을 조절하기 위한 전략으로는 두 가지가 제시되고 있다. 하나는 약물이 타겟 단백질이 생물학적 기능을 촉진할 수 있는 단백질의 표면에 직접적으로 결합하여 기능을 저해하는 것이다 (제 2 – 4 장). 다른 하나는 타겟 단백질에 결합하여 단백질 자체를 분해시키는 방법이다 (제 5 장). 본 박사 학위 논문에서는 다양한 형태의 화합물을 이용하여 단백질 간 상호작용을 단백질 표면에 직접 결합하여 저해시키는 저해제 발굴 및 표적 단백질 자체를 분해하는 전략을 개발하였다. 제 1 장에서는 단백질 간 상호작용이 생체 내에서 가지는 중요성을 소개하고 단백질 간 상호작용을 조절할 수 있는 두 가지의 화학 생물학적 전략에 대해서 소개한다. 제 2 장에서는 이합체 혹은 삼량체 펩타이드 화합물을 이용하여 단백질 간 상호작용을 저해하는 방법 개발에 대한 내용을 소개한다. 다가 상호작용을 통해서 단백질의 신호전달이 진행되는 예들이 많이 발견되고 있고 따라서 단백질의 다가 상호작용을 저해하는 전략이 중요하게 여겨진다. 하지만 이를 저해하기 위해서 이합체 혹은 삼량체의 화합물 합성은 어려움이 있었다. 본 연구에서는 고체 상 합성을 통해서 이합체 혹은 삼량체 펩타이드 화합물 합성법을 제시하고 이를 통해서 14-3-3σ 단백질 조절제를 발굴하였고 원래의 화합물에 비해 약 400 배의 향상된 결합력을 볼 수 있었다. 제 3 장에서는 제 2장에서 펩타이드를 이용한 화합물이 결합력에 비해서 낮은 세포투과성으로 인한 문제점을 극복하기 위해서 구조적으로 안정화된 저분자 화합물 개발 전략을 소개한다. 알파 헬릭스 구조를 모방할 수 있는 저분자 화합물에 링커를 도입함으로써 구조적 견고함을 가질 수 있게 되었고 이를 통해서 표적 단백질인 Mcl-1 에 더 효과적, 선택적으로 결합하는 화합물을 찾았다. 제 4 장에서는 3 장에서의 저분자 화합물이 가지는 단점을 극복하고 제 2 장의 펩타이드 화합물이 가지는 단점을 극복하기 위해서 스테이플 펩타이드를 이용하여 표적 단백질인 NCOA1의 기능을 조절하는 전략 개발에 대한 내용을 소개한다. 본 연구에서 디자인된 스테이플 펩타이드는NCOA1 단백질에 직접 결합하여 STAT6의 전사 기능을 도와주는 NCOA1 의 역할을 막아 STAT6 의 전사를 억제하였다. 결과적으로, 이 화합물은 NCOA1/STAT6 단백질 간 상호작용을 효과적으로 저해하고 펩타이드 화합물의 단점을 극복하고 향상된 세포 투과성과 생체내 안정성을 가지는 첫번째 화합물이다. 제 5장에서는 인체 내에서 단백질의 N 말단의 아미노산 인식을 통해 단백질의 주기를 결정하는 N-end rule 을 이용한 새로운 형태의 단백질 분해제 개발을 소개한다. E3 ligase 중 하나인 UBR Box 단백질의 리간드와 NCOA1을 표적으로 하는 스테이플 펩타이드 (4장) 리간드를 연결한 헤테로다이머를 디자인하였다. 이렇게 디자인된 화합물은 NCOA1 단백질을 효과적으로 분해하였고 더 나아가 유방암세포에서 전이에 필수적인 역할을 하는 NCOA1을 분해함으로써 세포 수준과 쥐 실험에서 유방암의 전이가 감소되는 결과를 보였다.

Aberrantly regulated protein-protein interactions (PPIs) are directly related to various diseases such as cancers and neurodegenerative diseases. Therefore, there is a great interest for developing molecules modulating PPIs in chemical biology and drug discovery field. In this thesis study, two types of chemical biology approaches are employed for modulating various PPIs. The first approach is developing the modulators which bind to interfaces of proteins and inhibit the target PPIs (Chapter 2-4). The other approach is developing chemical protein degraders via the ubiquitin-mediated proteolysis system (Chapter 5). In Chapter 1, the biological significance of targeting protein-protein interactions (PPIs) is explained, and background on chemical biology strategies for modulating PPIs are introduced. In Chapter 2, a new facile solid-phase method for the generation of multivalent ligands targeting PPIs is suggested. The developed solid-phase method enables the convenient and robust synthesis of multivalent ligands. The feasibility of the strategy was demonstrated by synthesizing fluorescently-labeled homo-dimeric peptide ligands targeting 14-3-3σ protein. Designed molecules led to dramatically increased binding affinities (~ 400-fold improvement) relative to a monomeric peptide ligand targeting 14-3-3σ protein. In Chapter 3, a strategy for generating conformationally restricted α-helix mimetic small molecules for inhibiting PPIs is introduced. Covalent bridges were incorporated to limit the rotation of α-helix mimetics around its central axis. Restricted α-helix mimetic small molecules have considerably enhanced binding affinity and specificity to the target protein Mcl-1 compared to unrestricted molecules due to its rigid conformation as well as extra interaction of the bridge with protein surface. In Chapter 4, the development of a cell-permeable, proteolytically stable, stapled helical peptide targeting nuclear receptor coactivator 1 (NCOA1) is described. Designed stapled peptide disrupts the NCOA1/STAT6 interactions, thereby repressing STAT6-mediated transcription. Furthermore, the first crystal structure of a stapled peptide in complex with NCOA1 is obtained using X-ray crystallography. In Chapter 5, a new class of proteolysis-targeting chimeric molecules that degrade target proteins via the N-end rule pathway is introduced. The N-end rule pathway is a conserved proteolysis system that degrades proteins having N-terminal degradation signal, called N-degrons. To induce the degradation of targeted protein via the N-end rule pathway, chimeric molecules consisting of N-degrons and the stapled peptide ligand for NCOA1 (Chapter 4) were designed. It is demonstrated that these chimeric molecules hijack E3 ligase to NCOA1 and effectively reduce the cellular level of NCOA1 thereby inducing the inhibition of metastasis and invasion in vitro and in vivo mice study.