Magnetic Nanoparticle-Based Detection of Pathogenic Bacteria

Abstract

본 논문에서는 병원균을 신속하게 포집 및 검출할 수 있는 자성나노입자 기반의 가상필터를 개발하는 연구를 진행하였다. 유체 채널 내에 형성된 가상필터가 높은 유량에서도 안정적으로 존재할 수 있는 방법을 개발함으로써, 대용량 샘플 내에 분포하는 병원균을 신속하게 농축시킬 수 있었다. 샘플을 흘려주는 유량을 높임으로써 짧은 시간 동안의 농축만으로도 높은 농도의 병원균 용액을 얻을 수 있었으며, 이를 통해 기존 검출법들의 민감도를 수 백배 높일 수 있었다. 본 논문은 3 개의 장으로 이루어져 있다. 1 장에서는 자성나노입자의 특성과 자성나노입자를 이용한 병원균의 농축 및 검출 방법에 대해 설명한다. 2 장에서는 자성나노입자로 구성된 가상필터를 이용하여 식수 내 병원균을 빠르게 검출할 수 있는 방법을 소개한다. 항체가 고정된 자성나노입자 용액을 유리관 안에 주입한 뒤 외부 자기장을 가하면, 항체가 고정된 자성나노입자는 자기장의 방향을 따라 배열되어 자성입자 벽을 형성한다. 유리관에 액체를 주입하면 자기력에 의해 고정되어 있던 자성나노입자를 밀어내게 되며, 유체에 의한 항력이 자기력보다 강해지면 입자는 유체와 함께 흘러나오게 된다. 반면, 구리테이프로 감싼 유리관(구리코팅관)에 액체를 주입하면 렌츠의 법칙에 의해 유체의 반대방향으로 자기장이 유도된다. 그 결과 구리코팅관 내에 자성나노입자가 유지될 수 있는 최대 유량은 일반 유리관에 비해 2.5 배 증가하였다. 본 개념의 검증을 위해 대장균 O157:H7이 들어있는 수용액을 항체가 고정된 자성나노입자가 들어있는 구리코팅관에 주입하였다. 이 때 자성나노입자 벽은 유체는 통과시키면서 병원균과는 결합할 수 있는 구조적 유연성을 나타내어 가상필터의 역할을 하였다. 대장균에 대한 ATP 발광법의 검출한계는 102 CFU/mL였으며, 포집 및 분리 과정을 위한 10 분을 포함한 전체 검사시간은 15 분이었다. 3 장에서는 더 높은 유량에서 병원균을 효율적으로 포집하기 위해 가상필터를 발전시키는 내용을 보고한다. 개선된 가상필터는 알긴산이 코팅된 자성나노입자를 교차 결합시켜 얻은 자성나노입자 사슬로 구성되었다. 일회용 플라스틱관 내의 자성나노입자 사슬 용액이 외부 자기장에 노출되면, 사슬은 자기력선을 따라 배열되며 고래수염의 여과 시스템과 유사한 필터 구조를 형성하였다. 외부 자기장의 공급원으로는 링 내부의 자기장이 강화된 할바흐 링을 사용하였다. 할바흐 링은 다른 링 형태의 자석 배치들보다 더 균일하면서도 밀집된 자성나노입자 사슬의 배열을 형성시켰다. 가상필터의 성능을 입증하기 위해 대장균이 들어있는 수용액을 폴리에틸렌이민이 코팅된 자성나노입자 사슬로 구성된 가상필터로 주입하고, 정전기적 반응으로 포집된 대장균의 농도를 RT-PCR 분석을 통해 결정하였다. 그 결과 자성나노입자 사슬을 이용한 병원균 포집효율은 유량 5 mL/min에서 90%를 나타냈으며, 10 분 간의 병원균 농축 후 검출한계는 10 CFU/mL로, 단일 RT-PCR을 이용한 검출한계보다 100 배 낮은 수치를 나타냈다. 더 나아가, 할바흐 링 뒤에 역추진 자석 링을 추가하여 환류 가상필터를 개발하였다. 할바흐 링으로부터 유출된 자성나노입자 사슬은 역추진 자석 링에 의해 다시 할바흐 링으로 되돌아감으로써, 15 mL/min의 높은 유량에서도 자성나노입자 사슬들이 관 안에 유지되었다. 환류 가상필터가 들어있는 관에 150 mL의 대장균 용액을 주입하였을 때, 포집효율은 90%를 나타냈으며, 10 분 간의 병원균 농축 후 검출한계는 2 CFU/mL로, 단일 RT-PCR에 비해 민감도가 500 배 향상되었다. 본 연구결과는 가상필터를 이용하여 대용량 샘플 내 병원균을 신속하게 포집할 수 있어, 보다 신속하고 민감하게 병원균을 검출하는 것이 가능함을 보여준다. 가상필터는 용액 샘플 내 병원균의 농축 뿐만 아니라, 공기 중의 바이러스 포집이나 합성된 단백질의 정제 등 다양한 분야에의 사용이 기대된다.

In this thesis, virtual filters were developed for rapid capture and detection of pathogenic bacteria using magnetic nanoparticles (MNPs). By developing methods in which a virtual filter formed in a fluidic channel can stably exist even at a high flow rate, bacteria can be quickly concentrated from a large volume of samples. Due to the high flow rate of the sample flow, a high concentration of bacterial solution was obtained within a short period of time, thereby increasing the sensitivity of existing detection methods by several orders. This thesis consists of 3 chapters. Chapter 1 describes general introduction about MNPs and methods for concentration and detection of pathogenic bacteria using MNPs. Chapter 2 introduces a method for rapid detection of pathogenic bacteria from water using a virtual filter comprising MNPs. When an external magnetic field was applied to the antibody-functionalized MNP (Ab-MNP) solution in a glass tube (GT), the Ab-MNPs were aligned along the direction of the applied magnetic field to form a wall of MNPs. The injection of a liquid into the GT pushed the MNPs to flow when the drag force exceeded the magnetic force that held the MNPs. In contrast, injection of a liquid into the GT wrapped with a copper tape (Cu-GT) created a magnetic field in the opposite direction of the liquid flow according to Lenz’s law, which retained the MNPs inside Cu-GT even at a flow rate 2.5 times higher than the maximum flow rate at which the MNPs were retained inside the GT. As proof of concept, E. coli O157:H7-spiked aqueous solutions were injected into Cu-GT containing Ab-MNPs. The structural flexibility of the Ab-MNP wall allowed the liquid to pass through but induced binding of the bacteria to the Ab-MNP wall, just as the wall acted like a virtual filter. The detection limit was 102 CFU/mL of E. coli as measured by an ATP luminometer, and the total assay time was 15 min including 10 min for the isolation and separation steps. Chapter 3 reports the improvement of the virtual filter to capture pathogenic bacteria at a higher flow rate. The virtual filter comprised magnetic nanoparticle chains (MNCs) obtained by crosslinking alginate-coated MNPs. When the MNC solution in a disposable plastic tube was exposed to an external magnetic field, the MNCs were aligned along the magnetic field lines, forming a filter similar to a whale’s baleen filtering system. A Halbach ring that increased the magnetic field inside the ring was used as the source of an external magnetic field. The Halbach ring produced a more uniform and denser alignment of MNCs than any other ring array. To demonstrate the performance of the virtual filter comprising MNCs, Escherichia coli (E. coli) O157-spiked water was injected to the virtual filter comprising polyethyleneimine-coated MNCs, and the concentration of E. coli O157 captured by electrostatic interaction was determined using RT-PCR analysis. The bacterial capture efficiency using MNCs was 90% at a flow rate of 5 mL/min, and the detection limit after 10 min of pre-concentration of bacteria was 10 CFU/mL, which is 100 times lower than that obtained using RT-PCR alone. In addition, reflux integrated virtual filter was developed using a reverse thrust magnetic ring (RTM-ring). MNCs released from the Halbach ring returned to the Halbach ring again by the RTM-ring, and MNCs under the reflux were retained in the tube even at a flow rate of 15 mL/min. The injection of 150 mL of E. coli O157-spiked water into the channel with the reflux integrated virtual filter resulted in 90% bacterial capture efficiency within 10 min, and the detection limit by RT-PCR after the pre-enrichment was 2 CFU/mL, which is 500 times more sensitive than that of conventional RT-PCR. This thesis showed that pathogenic bacteria in a large volume of samples can be detected quickly and sensitively by the rapid pre-concentration using the virtual filter. It is expected to be used in various applications such as virus capture in the air samples or purification of synthesized proteins.