세포 소기관 유래에 따른 엑소좀 모사 나노소포의 다양성

Abstract

Exosomes, naturally-secreted nanovesicles from cells, were known to promote intercellular communication and to deliver cellular materials. Therefore, the interest in exosomes has been increased due to their critical roles in health and disease and their potential clinical application in therapy and diagnosis. However, low yield of exosomes is bottleneck for further research and for practical usage in therapeutic applications. Cell-engineered nanovesicles (CNVs) are considered as an alternative to exosomes, because they can be produced efficiently on a large scale and also have been successfully reported in several applied research. However, CNVs may originate from the various organelles, i.e., part of them may cause adverse effects to recipient cells, but the information for their origin has not yet been identified. In this study, we air-sprayed human embryonic kidney 293 (HEK293) cells into lipid-bilayer CNVs. To identify the subcellular origin of the CNVs, nine different HEK293 cell lines were prepared by transfection with organelle-specific fluorescent protein plasmids that targeting plasma membrane, peroxisome, lysosome, early endosome, late endosome, nucleus, mitochondrion, Golgi apparatus, endoplasmic reticulum. The origin of CNVs were identified by measuring fluorescence expressions for organelle-specific markers using fluorescence nanoparticle tracking analysis (NTA). In the results, we found that CNVs derived from plasma membrane constituted the largest portion, but the CNVs derived from other organelle membranes are non-negligible portion as well. This information will be useful to guide advanced research on outer membrane vesicles and exosome-mimetic nanovesicles engineered from cells.

본 연구논문은 엑소좀 모사 나노소포 (exosome-mimetic nanoveiscles) 의 효율적인 제조를 위한 스프레이 및 압력 기반 cell-engineered nanovesicles (CNVs) 제조 방법 개발과, 이 방법을 통해 제조된 CNVs의 세포 소기관 유래에 따른 다양성 (heterogeneous subcellular origin) 을 기술한다. 엑소좀 (Exosome) 은 세포가 분비하는 나노사이즈 (30nm – 200nm) 의 소포로서, 세포간 신호전달에 중요한 역할을 하고 원세포로부터 유래한 세포 내 물질들을 표적 세포에 전달하는 역할도 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 치료 및 진단에 대한 잠재적 가치 때문에 엑소좀에 대한 관심이 증가되어 오고 있으나, 엑소좀의 낮은 수율은 다양한 추가 연구 및 치료 응용 분야 연구를 진행하는데 큰 걸림돌이다. 이 한계점을 극복하기 위해 세포를 특정 구조물을 가진 마이크로채널을 통과시키는 방법, 원심력을 이용하여 압출 장치 또는 스핀 컵에 장착한 마이크로 사이즈 필터를 통과시키는 방법, 그리고 초음파 처리 과정을 이용한 방법과 같은 기계적인 힘을 이용하여 엑소좀 모사 나노소포인 CNVs를 제조하는 여러 연구가 진행되어 왔다. 엑소좀 보다 수십 배 많은 생산량을 가진다는 장점이 있는 CNVs는 엑소좀과 비슷한 크기 및 모양을 가지고 RNA와 단백질 같은 세포 내 물질도 함유하고 있으며, 또한 치료 약물 및 RNA 전달과 세포 증식 및 분화 유도에 대한 연구에서 그 효능을 입증했다. 비록 앞서 언급한 방법들이 성공적으로 CNVs를 만들었지만, 마이크로채널 시스템의 작은 장치 크기로 인해 한번에 생산되는 양에 제한이 있다는 점과 연속적인 다른 크기의 마이크로 필터를 통과시키는 과정이 요구되는 압출 장치 및 스핀컵 방법은 다소 번거롭다는 단점이 있다. 본 연구에서는 이러한 단점을 극복하기 위하여 에어스프레이와 압력을 이용한 CNVs 제조 방법을 개발하였다. 이 제조 방법의 메커니즘은 외부 압축기로부터 연결된 에어스프레이 분출 압력과 대기압과의 압력 차이에 의해 세포를 부시고 이 세포 파편들이 자발적으로 자가조립 (self-assembly) 하여 CNVs가 되는 것이다. 본 제조 방법은 외부 압력을 이용하고 반복 공정이 가능한 스프레이를 사용한다는 점에서 기존 제조 방법들 보다 더 간단하고 대량생산에 적합한 제조 방법이다. 본 개발 방법을 통해 제조한 CNVs 3개의 밀도 분획과 엑소좀과의 크기 및 형태의 유사성, 같은 세포 개수로부터 얻어진 생산량의 차이, 그리고 원세포와 비교한 각 CNVs밀도 분획에 따른 RNA 특징을 분석하였다. 그러나 원형질막뿐만 아니라 다양한 세포 소기관으로부터 제조된 CNVs는, 예를 들어 핵으로부터 유래한 CNVs는 질병과 관련 있는 핵막 단백질로 인하여 또는 라이소좀 및 미토콘드리아로부터 유래한 CNVs는 세포 사멸 과정에 기여하는 이들의 역할 때문에, 표적 세포에 예상하지 못한 부작용을 일으킬 수 있다. 본 연구논문은 CNVs의 세포 소기관 유래를 확인하기 위하여, 인간배아신장 (human embryonic kidney 293) 세포에 9개의 각기 다른 소기관 막 단백질을 타겟팅하는 초록 (mEmerald or GFP) 형광 단백질플라스미드 DNA를 형질주입 (transfection) 하였다. 본 연구에서 다룬 9개의 소기관은: 원형질막 (plasma membrane), 퍼옥시좀 (peroxisome), 라이소좀 (lysosome), 초기 엔도좀 (early endosome), 후기 엔도좀 (late endosome), 핵 (nucleus), 미토콘드리아 (mitochondrion), 골지체 (Golgi apparatus), 소포체 (endoplasmic reticulum) 이다. 준비된 9종의 형질주입 세포를 이용하여 CNVs를 제조한 후, 두개의 레이저를 장착한 형광 나노 입자 추적 분석 장치 (fluorescence nanoparticle tracking analysis)를 이용하여520 nm 레이저로부터 전체 CNVs의 개수를 측정하고 488 nm 레이저로부터 특정 소기관 유래 CNVs 개수를 측정하였으며 이들의 비율 즉 [특정 소기관 유래 CNVs 개수 / 전체 CNVs 개수]를 계산하여 CNVs의 세포 소기관 유래에 따른 다양성에 대한 정보를 퍼센트로 나타내었다. 3개의 밀도 분획으로 분리한 CNVs 소그룹 각각에 대한 결과에서, 원형질막 유래 CNVs가 가장 많은 부분을 차지하였지만 다른 소기관 유래 CNVs 역시 무시할 정도의 부분은 아님을 밝혔다. 이전의 많은 논문에서 원형질막 유래 나노소포가 무해하다고 밝혔기 때문에 제조된 CNVs는 선택적으로 사용될 필요가 있으며, CNVs의 세포 소기관 유래 다양성은 잠재적인 부작용을 방지하기 위하여 최소화되어야 한다. 본 연구논문에서 개발한 CNVs 제조 방법은 높은 생산성과 간편성으로 인하여 다양한 치료 및 의학연구에 활용할 수 있는 잠재성을 충분히 갖추었고, 본 연구논문에서 밝힌 밀도에 따른CNVs 소그룹들의 세포 소기관 유래 다양성에 대한 정보는 엑소좀 모사 나노소포 분야의 이후 연구 방향을 안내할 것으로 기대된다.