Development of Boronic Acid-based Probe for Dopamine and Cell Surface Glycan

Abstract

The boronic acid binds to 1,2- or 1,3-diol selectively and reversibly. Taking advantage of this property, boronic acid is used to develop probes of dopamine and glycans with diols. This thesis contains the development of boronic acid-based dopamine turn-on sensors (Chapter 1) and boronic acid-based cell surface glycan probe (Chapter2).

Chapter 1. development of boronic acid-based dopamine turn-on sensor.

Neurotransmitters are chemical messengers that transmit signals between neurons, the cells that consist of a nervous system of the brain. Dopamine is a type of neurotransmitter that plays a vital role in motivation, awakening, reinforcement, reward, and motor control. Dysfunctions of the dopamine cause diseases such as schizophrenia, Parkinson's disease, ADHD, bipolar disorder, and addiction. Therefore, researches on fluorescent sensors that detect dopamine for the diagnosis of diseases and monitoring the dopamine level have been conducted. Many prior studies reported turn-off dopamine sensors. Turn-on sensors have high selectivity over turn-off sensors, due to their non-fluorescence properties without analytes. Therefore, developing a dopamine turn-on sensor is highly desirable. The goal of this chapter is to develop a dopamine turn-on sensor that logically modifies the turn-off sensor based on the PET mechanism. PET is a fluorescence quenching mechanism in which the excited electron transfer donor to acceptor. Thus, it is possible to control the turn-on and off of fluorescence by adjusting the molecular orbital of the electron donor or electron acceptor. To achieve the purpose of this study, a high-throughput screening of a boronic acid-conjugated fluorescent library with dopamine resulted in the discovery of dopamine turn-on sensor candidates. The molecular orbital of this candidate compounds before and after the dopamine binding were calculated using DFT. Based on the results of the calculation, the turn-on sensor was rationally designed and synthesized. The synthesized compound of this chapter is expected to show a turn-on signal with dopamine.

Chapter 2. development of boronic acid-based cell-surface glycan probe.

Glycans refer to carbohydrates portion of glycoconjugates, as well as carbohydrates linked to each other. Glycan is the most abundant organic molecules in the living system. Notably, the cell-surface glycan is involved in a variety of biological events such as differentiation, cell adhesion, fertilization, cell-cell recognition, and inflammation. Therefore, cell-surface glycan study is significant. However, it has been less studied because of its complexity and diversity. There are two major current approaches for glycan study: mass spectrometry-based approach and lectin based approach. The mass spectrometry-based approach allows for sensitive analysis but has a limitation that requires additional instruments and expertise and challenging to analyze for complex and informationless glycans. The lectin-based approach is quick and simple but it has its cytotoxicity, limited number, high price, and weak interaction with glycans. Therefore, it is necessary to develop a new technique for glycan research that can supplement the limitations of these approaches. The goal of this chapter is to develop a novel, simple, inexpensive, sensitive, and high affinity-based boronic acid-based technique for differentiating cells through cell surface glycan changes caused by various biological phenomena. To achieve the purpose of this study, the following three approaches were used: fluorescent-tagged boronic acid approach, lectin-mimicking boronic acid approach, and DOTA-tagged boronic acid approach. The prior studies of fluorescent-tagged boronic acid approaches have limitation in that uses only one type of boronic acid to distinguish monosaccharides. To overcome the limitations, a fluorescent-tagged boronic acid library which has various species of boronic acid was synthesized. It is expected to be a tool to observe the interaction of different glycans on the cell surface according to the type of boronic acid. However, the fluorescent-tagged boronic acid approaches still suffer from a weak interaction with the glycan. There are ways to introduce multiple boronic acids into a molecule to increase the interaction of glycan and boronic acid. We proposed a lectin-mimicking boronic acid approach and a DOTA-tagged boronic acid approach. The second approach, the lectin-mimicking approach, introduces multiple boronic acids into a peptide sequence, which can differentiate cell-surface glycans according to the type of boronic acid, the type and sequence of the peptide, and provide higher affinity than lectin. Several attempts have been made to introduce multiple boronic acids into cyclic peptides, linear peptides, and linear peptoids. The third approach, DOTA-tagged approach, introduces multiple boronic acids to DOTA, a metal chelator, making it possible to synthesize various compounds according to the type of boronic acid and the type of linker. More, this approach is expected to be a technique that replaces expensive metal-tagged antibodies used in CyTOF. The synthesized compounds of this chapter are expected to be a novel technique for glycan study that copes with the prior techniques. Moreover, this study is expected to help understand the various biological events resulting from cell-surface glycan differentiation.

보론산은 1,2-혹은 1,3-다이올과 가역적, 선택적으로 반응한다. 이러한 특성을 이용하여, 보론산은 다이올을 가지고 있는 도파민과 글라이칸의 위한 프로브 개발의 연구에 사용되고 있다. 본 학위 논문은 제 1장. 보론산 기반의 도파민 턴온 센서의 개발, 제 2장. 보론산 기반의 세포 표면 글라이칸 프로브의 개발으로 이루어져있다.

제 1장. 보론산 기반의 도파민 턴온 센서의 개발

신경전달물질은 뇌의 신경계를 구성하는 세포인 뉴런 사이에서 신호를 전달하는 물질이다. 도파민은 이러한 신경전달물질의 한 종류로, 동기부여, 각성, 강화, 보상, 운동제어 등을 조절하는 중요한 역할을 하고 있다. 도파민의 기능 장애는 조현병, 파키슨병, 주의력 결핍 및 과잉 행동 장애, 양극성 장애 및 중독과 같은 질병을 유발한다. 따라서 이러한 질병의 진단 및 도파민 수준의 모니터링을 위해 도파민을 검출하는 형광 센서에 대한 연구가 진행되고 있다. 기존의 도파민 형광 센서는 대부분이 턴-오프 센서로, 턴-오프 센서보다 선택적인 턴-온 센서의 개발이 필요하다. 본 연구의 목적은 PET메커니즘을 기반으로 턴-오프 센서를 논리적으로 수정하여 도파민 턴-온 센서를 개발하는 것이다. PET는 여기된 전자가 전자 공여체에서 전자 수용체로 이동하면서 형광이 꺼지는 메커니즘으로 전자 공여체 혹은 전자 수용체의 분자 궤도 함수를 조절하여 형광의 켜고 꺼짐을 조절할 수 있다. 따라서 본 연구의 목적을 달성하기 위해 기존의 보론산 기반의 형광 화합물들을 스크리닝하여 도파민에 형광 변화를 보이는 화합물을 찾은 후, 이 후보 화합물의 도파민과의 반응 전, 후의 분자 궤도 함수를 DFT로 계산하였다. 이 계산을 바탕으로 논리적으로 턴온 센서를 디자인하고 이를 합성하였다. 본 연구에서 계산을 기반한 예측으로 합성된 화합물은 도파민과 반응하여 턴-온 시그널을 보일 것으로 기대된다.

제 2장. 보론산 기반의 세포표면 글라이칸 프로브의 개발

글라이칸은 탄수화물이 서로 연결 되어있는 것뿐만 아니라 당포합체의 탄수화합물 부분까지 포함한다. 글라이칸을 이루고 있는 탄수화물은 생체 조직을 이루고 있는 유기 분자 중 가장 많이 존재하며, 특히, 세포 표면의 글라이칸은 세포 분화, 세포 부착, 수정, 세포-세포 인식 및 염증반응과 같이 다양한 생물학적 현상에 포함되어 이에 대한 연구는 중요하다. 이러한 중요성에도 불구하고 글라이칸의 복잡성과 다양성으로 인해 연구에 어려움을 겪고 있다. 글라이칸 연구를 위한 기존의 접근 방식으로는 질량분석기를 사용하는 방법과, 렉틴 단백질을 사용하는 방법이 있다. 질량분석기를 사용하는 접근 방식은 민감한 분석을 가능하게 하지만, 추가적인 기기와 전문성이 요구되며 복잡하고 정보가 부족한 글라이칸에 대해서는 분석이 어렵다는 한계점이 있다. 렉틴 단백질을 사용한 분석 방법은 빠르고 간단하나, 그 자체의 세포 독성과 적은 수, 비싼 가격을 가지고 있으며, 또한 글라이칸과의 상호작용이 약하다는 한계점이 있다. 그러므로 이러한 기존 방법의 한계점들을 보완할 수 있는 글라이칸 연구를 위한 새로운 기술의 개발이 필요하다. 본 연구의 목적은 다양한 생물학적 현상에따른 세포 표면의 글라이칸의 변화를 단순하고 저렴하며 민감하고 높은 친화도로 구분할 수 있는 보론산을 기반으로 한 새로운 기술을 개발하는 것이다. 본 연구의 목적을 달성하기 위해 다음의 세가지 접근 방법-형광체에 보론산을 도입하는 방법, 렉틴을 모방하여 보론산을 도입하는 방법, 그리고 도타 화합물에 보론산을 도입하는 방법을 사용하였다. 첫번째, 형광체에 보론산을 도입하는 방법에는 기존의 본 접근 방법에서 한가지 종류의 보론산을 사용하여 탄수화물 단량체를 구분하는 정도의 적용에 그쳤다는 한계를 극복하기 위해, 여러가지 종류의 보론산을 형광체에 도입하는 라이브러리를 합성하였다. 이는, 보론산의 종류에 따른 서로 다른 세포 표면의 글라이칸과의 상호작용을 관찰할 수 있는 도구가 될 것으로 기대된다. 그러나 첫번째 접근 방식은 여전히 글라이칸과의 상호작용이 약하다는 한계점이 있다. 글라이칸과 보론산의 상호작용을 높이기 위해서는 한 분자에 여러 개의 보론산을 도입하는 방법이 있다. 이 방법으로 렉틴을 모방하여 보론산을 도입하는 방법, 그리고 도타를 이용하여 보론산을 도입하는 방법을 제안하였다. 두번째 방법인 렉틴 모방 접근법은 펩타이드 시퀀스에 여러 개의 보론산을 도입하는 방법으로, 보론산의 종류와 펩타이드의 종류와 서열에따라서 세포 표면의 글라이칸을 구분할 수 있으며, 렉틴보다 더 좋은 친화성을 가진 다는 장점이 있다. 원형의 펩타이드, 선형의 펩타이드, 선형의 펩토이드에 여러 개의 보론산을 도입하는 방법이 시도되었다. 세번째 방법은 여러 개의 보론산을 도타에 도입하는 방법으로, 보론산의 종류와 도타의 링커에따라 다양한 화합물의 합성이 가능하며, CyTOF기술에 사용되는 메탈이 부착된 항체를 대체할 수 있는 기술로 기대가 된다. 본 연구를 통해 합성된 화합물은 기존의 연구방식들을 대처하는 글라이칸 연구를 위한 새로운 기술이 될 것으로 기대된다. 또한, 본 연구는 세포 표면 글라이칸의 분화로 인한 다양한 생물학적 현상을 이해하는 데 도움이 될 것으로 기대된다.