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애기장대의 교차 억제 인자 HIGH CROSSOVER RATE1의 유전학적 발굴 및 기능 연구

Title
애기장대의 교차 억제 인자 HIGH CROSSOVER RATE1의 유전학적 발굴 및 기능 연구
Authors
김재일
Date Issued
2021
Publisher
포항공과대학교
Abstract
감수분열 과정에서 교차 현상을 통해 모계와 부계의 염색체가 섞이게 되는데, 이는 자손의 유전적 다양성을 증가시켜 환경 변화에 대한 생존 가능성을 높인다. 감수분열 과정에서 염색체는 다양한 감수분열 특이적 단백질들에 의해 형성된 축에 응집되며, DNA 이중 가닥 절단과 이의 수선 과정에서 교차 현상이 일어난다. 교차가 일어나기까지 일련의 과정은 감수분열 단백질들의 순차적이고 정교한 조절을 통해 이뤄지며, 이는 식물을 포함한 다양한 종에서 보존되어 있다는 것이 광범위한 감수분열 연구를 통해 밝혀졌다. 감수분열 동안 축 형성부터 DNA 절단, 시냅스 형성과 분리 등 순차적으로 일어나는 각 과정은 감수분열 단백질 복합체들에 의해 매개된다. 각각의 단계가 수 시간 정도의 비교적 짧은 시간 동안 진행되므로 이 단백질 복합체들의 조절 역시 빠르게 이뤄져야한다. 최근 연구를 통해 인산화, 유비퀴틴화, SUMOylation 등 단백질 변형이 이러한 빠른 조절에 중요한 역할을 한다는 증거들이 발견되고 있으며, 그 기작을 밝히기 위한 연구들이 진행 중이다. 본 학위 논문에서는 최근 식물 종에서 감수분열 과정의 DNA 절단과 교차 형성을 조절하는 감수분열 단백질 복합체들의 구성과 신호 전달 및 단백질 변형에 관한 연구 내용들을 정리하였다. 또한 class I 교차를 매개하는 ZMM 단백질들과 class II 교차를 억제하는 교차 억제 인자들의 역할에 대해 밝혀진 내용들을 요약하였다. 교차 현상은 DNA 서열의 변화로 나타나며 그 위치를 추적하고 교차율을 측정하는 것은 쉽지 않다. 이를 시각적으로 나타내고 쉽게 측정하기 위해 애기장대 종자/꽃자루에서 형광 단백질을 발현시킨 형광 종자/꽃가루 리포터 시스템이 고안되었다. 일정 간격을 두고 서로 다른 종류의 형광 단백질을 발현하는 transgene을 도입한 형질전환체에서, 꽃가루 tetrad의 형광 패턴을 바탕으로 구분한 타입 별 비율을 측정하여 교차율과 교차 간섭을 계산할 수 있다. 하지만 tetrad를 하나하나 눈으로 확인하고 그 타입을 특정하여 계산하는 것은 쉽지 않은 일이므로 다량의 데이터를 얻기에는 한계가 있었다. 이러한 문제점을 딥러닝 기반의 이미지 분석을 통해 자동화하여 high-throughput 측정이 가능토록 하는 DeepTetrad 패키지를 구축함으로써 해결하였다. 이 과정에서 저자는 프로그램을 코딩하고 시뮬레이션한 생물정보학 전공자와 함께 일하며, 꽃가루 측정 조건을 테스트하여 최적화하고 다량의 꽃가루 사진을 확보하였다. 또한 매뉴얼 측정을 진행하여 시뮬레이션 결과와 비교함으로써 DeepTetrad 구축에 중요한 역할을 수행하였다. 형광 꽃가루 tetrad 측정에 DeepTetrad를 활용함으로써 기존에는 힘들었던 교차 저해 및 gene conversion 돌연변이체 스크리닝이 가능해지는 등, DeepTetrad는 감수 분열 연구를 가속하는 유용한 수단이 될 것으로 전망한다. 유성생식을 하는 대부분의 종에서 교차는 감수분열 중 형성되는 DNA 절단 개수에 비해 제한된 수량만 일어나며, 이 과정은 식물을 비롯한 광범위한 생물 종에서 보존된 감수분열 단백질들에 의해 조절된다. 식물체에서 대부분의 교차는 ZMM 단백질들이 조절하며 교차 간섭 현상이 있는 Class I 경로를 통해 형성되고, MUS81에 의해 매개되는 Class II 경로를 통해 소수가 형성된다. Class II 경로의 DNA 수선 과정에서 대부분의 DNA 절단은 FANCM, RECQ4, FIGL1 등 교차 억제 인자에 의해 non-crossover로 유도되지만, Class I 경로의 경우 이 같은 교차 억제 인자가 알려지지 않았다. 애기장대에서 교차 조절 인자를 찾기 위해 형광 종자 리포터 라인을 활용하여 유전학적 스크리닝을 진행하였다. 교차율 증가 돌연변이체를 동정하여 high crossover rate1 (hcr1)으로 명명하고, SHOREmap을 통해 유전체 서열을 분석하여 원인 유전자 후보군을 선별하였다. 유전학적 실험을 통해 PROTEIN PHOSPHATASE X1 (PPX1)으로 명명된 탈인산화 효소 유전자의 돌연변이가 hcr1의 표현형을 유발하는 것을 검증하였다. PPX1은 광범위한 생물 종에서 보존된 탈인산화 효소 PP4 복합체의 catalytic subunit으로 기능한다. 다양한 형광 종자 및 형광 꽃가루 리포터 라인에서의 교차율 분석을 통해 hcr1에서 chromosomal arm 지역의 교차율 증가 패턴을 확인하였다. HCR1/PPX1의 homologue인 PPX2 역시 교차율에 영향을 주며 PPX1과 상호보완적임을 PPX1 및 PPX2 이중 돌연변이체 및 knockdown 형질전환체 분석을 통해 밝혔다. 이 형질전환 식물체로 F1 잡종 라인을 구축하고 genotyping-by-sequencing (GBS) 라이브러리 제작 및 분석을 통해 잡종 식물체에서 순종과 유사한 교차율 증가 패턴을 확인하였다. 감수 세포(meiocyte)에서 ZMM 단백질의 일종으로 class I 교차 위치를 보여주는 MLH1 foci 개수가 hcr1에서 증가하고 교차 간섭이 감소하는 현상을 바탕으로 HCR1이 class I 교차의 억제 인자로 기능함을 알 수 있었다. Y2H와 protoplast Co-IP 실험에서 HCR1이 HEI10, PTD, MSH5 및 MLH1 등 ZMM 단백질들과 결합한다는 사실이 이를 뒷받침한다. hcr1과 fancm, zip4 다중 돌연변이체에서의 유전학적 분석을 통해 HCR1이 class II 교차 억제에도 기여함을 확인할 수 있었다. HCR1과 관련한 일련의 연구 과정에 주저자로 기여하며, HCR1이 감수 분열 단백질들의 인산화 조절 인자로 추측되며 교차 저해 인자로 기능함을 알게 되었다. 추후 후속 연구를 통해 HCR1의 타겟 단백질과 조절자들을 알게 된다면 감수분열 과정에서의 인산화 조절과 교차 조절 기작에 대한 이해와 정교한 조작이 가능해질 것이다. 본 학위논문의 연구 성과를 작물에 적용할 수 있다면 농업 발전과 작물 육종을 통한 품종 개량에 기여할 수 있을 것이다. 또한 PP4 복합체의 초기 식물 발달과정에서의 기능을 MIGS를 활용한 조직 특이적 knockdown 기술을 통해 알아볼 수 있다.
During meiosis, the maternal and paternal chromosomes are recombined by crossovers, which increases the genetic diversity of progenies. Chromosomes converge on the axes formed by various meiosis-specific proteins, and crossovers are formed during DNA double strand breaks (DSBs) repairing processes. Extensive studies for meiosis have shown that meiotic pathways are mediated by sequential and sophisticated regulation of meiotic proteins, which are preserved in various species, including plants. Since each meiotic stage lasts for a short period of time, the regulation of meiotic proteins must also be done quickly. Recent studies have discovered evidence that protein modification, such as phosphorylation, ubiquitination, and SUMOylation, plays an important role in this rapid regulation. I summarized the composition of meiotic protein complexes that regulate the DSBs formation and crossover of meiotic processes in plant species, as well as their signalling and protein modification. Crossovers cause changes in DNA sequence and tracking its location and measuring the crossover rate is hard to perform. To measure the crossover rate in Arabidopsis, a pollen tetrad system was devised using a qrt1-1 mutant that daughter cells are attached together after meiosis. Apart from each other with an interval, transgenes expressing different fluorescent proteins were introduced into the qrt1-1 mutant. Crossover rate and interference are calculated by measuring the number of each tetrad types based on fluorescence patterns of pollen tetrad. However, it was hard works to visually check each tetrad and classify its type, so there was a limit to obtaining large amounts of data sets. This problem was addressed by building a DeepTetrad program package that enables high-throughput measurement by automating it through deep learning-based image analysis. In this process, I set up the best conditions for pollen photograph, pictured large amounts of pollen photographs and manually counted tetrad types to comparing them with simulation results. DeepTetrad is expected to be used as a useful tool for accelerating meiosis research, such as enabling previously challenging crossover interference mutant screening. In most species, crossover occurs in limited quantities compared to the number of DSBs formed during meiosis. Crossover formation is controlled by meiotic proteins preserved in plants and a wide range of other species. In plants, crossovers are mostly formed through the Class I pathway regulated by ZMM proteins, and a minority through the Class II pathway mediated by MUS81. In the Class II pathway, most meiotic DSBs are repaired to noncrossover regulated by anti-crossover factors such as FANCM and RECQ4, but such anti-crossover factors are unknown for Class I pathways. Genetic screening was carried out using fluorescent seed reporter lines to find crossover regulatory factors in Arabidopsis. The mutants with increased crossover rate were identified and one is named as high crossover rate 1 (hcr1). The genomic sequence of hcr1 was analyzed via SHOREmap to select causal gene candidates. Genetic experiments have verified that mutations in the phosphatase gene named PROTEIN PHOSPHATASE X1 (PPX1) cause crossover change of hcr1. PPX1 functions as a catalytic subunit of the PP4 holoenzyme complex preserved in a wide range of species. Analysis of crossover rate in fluorescent seed and fluorescent pollen reporter lines at various locations confirms the pattern of increasing crossover rate in chromosomal arm regions of hcr1. Analysis of crossover rates of PPX1 and PPX2 knockdown lines revealed that PPX2 also affects the crossover rate and is complementary to PPX1. I generated F1 hybrid of PPX1 and PPX2 knockdown lines and produced the genotyping-by-sequencing (GBS) library to analyze the pattern of crossovers in hybrid plants and found it is similar to inbred plants. In hcr1, the number of MLH1 foci in meiocytes were increased and crossover interference was decreased. It shows class I crossovers were increased in hcr1 and HCR1 functions as an anti-crossover factor of class I crossover. In yeast two-hybrid (Y2H) and protoplast Co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments, HCR1 binds to ZMM proteins such as HEI10, PTD, MSH5 and MLH1. Genetic analysis of hcr1, fancm and zip4 mutants shows that HCR1 also contributes to suppression of class II crossover. Contributing to a series of studies on HCR1, I found that HCR1 is presumed to be a phosphorylation regulator for meiotic proteins and functions as an anti-crossover factor. If this research is applied to crops, it will contribute to agricultural development through crop breeding.
URI
http://postech.dcollection.net/common/orgView/200000506602
https://oasis.postech.ac.kr/handle/2014.oak/114136
Article Type
Thesis
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