Studies on the influence of distinct naïve CD8+ T cell subsets on the induction of inflammatory bowel disease

Abstract

오늘날까지 염증성 장 질환 (Inflammatory bowel disease)은 유전적, 환경적 요인들에 의한 과도한 점막 면역반응에 의해 매개 된다고 알려져 있다. 대장에 국한하여 발생하는 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis)과 입에서 항문에 이르기까지 소화기 전반에 걸쳐 발생하는 크론병 (Crohn’s disease)이 대표적인 염증성 장 질환이며, 이들 질환들에 대한 치료책 모색 또한 과활성 상태의 면역반응을 억제 시키는 방향으로 진행 되어 왔다. 초기 마우스를 이용한 장염 실험 모델을 통해 비정상 적인 Th1, Th2 세포들의 증가를 확인함으로 이들 세포들이 장 점막조직에서 염증반응을 유도하는 주된 원인이라 생각되었으나, 후속 연구들에서 Th1의 분화를 억제하기 위해 투여한 IL-12 수용체에 대한 항체가 실은 Th17 세포 분화에 중요한 IL-6 수용체에도 결합하여 IL-6 신호 전달 또한 억제 함이 밝혀진바 있다. 결국 염증성 Th17 세포가 IBD 발병에 있어 주된 원인으로 부상 하였고, 뒤이어 IL-17을 분비하는 CD8+ T 세포, Tc17 세포 또한 IBD 발병과 병증의 심화에 관여함이 밝혀졌다. 또한 Th17/Tc17 두 세포의 분화 기전의 유사성에 기인하여 많은 연구들이 염증성 Th17/Tc17 세포의 분화를 유도 또는 억제하는 기전을 밝히는 것에 주안점을 두어 왔다. 염증성 Tc17세포는 장간막 림프절에서 형성되어 고유점막층으로 이동, 염증반응을 유도한다. 이로 인한 장 상피세포의 물리적 장벽의 와해는 보다 많은 장내 항원들의 유입을 허용하고 고유점막층의 염증성 Tc17 세포의 증식을 유도, 병증의 심화로 이어지게 된다 (Figure 1-1).

선행 연구들에서 T 세포의 발달, 이동, 생존, 그리고 기능적 능력 형성에 있어 자가 항원에 대한 T 세포 수용체 (T cell receptor)의 반응성이 중요함이 밝혀져 왔다. 또한 T 세포 수용체의 자가 항원에 대한 반응성에 있어 T 세포들 간 이소성이 존재함이 입증된 바, CD5의 발현 차이가 TCR과 자가항원과의 상호작용 강도를 가늠할 수 있는 지표가 되며 그 발현 정도는 흉선선택과정에서 받은 TCR 신호 강도에 비례함이 증명된 바 있다. 비록 T 세포가 받는 자가항원인식의 강도 차가 T 세포의 기능적 역할에 미치는 영향에 대해서는 아직 불분명하나, 신생 CD4+ T세포를 이용한 최근 연구에서 T세포에서 CD5발현의 정도와 TCR이 인지 가능한 외래항원에 결합하는 강도 사이에 흥미로운 상관 관계를 보여주었다. 마찬가지로 신생 CD8+ T세포에서도 자가항원에 대한 TCR 친화성이 높은 T세포(CD5hi)가 외래 항원에 대해 뛰어난 반응을 보임이 보고되었다.

장염 모델쥐에서도 자가 항원에 대한 서로 다른 반응성을 갖는 신생 CD4+ T세포 아집단 (CD5lo, CD5hi)을 이용하여 염증반응유도에 있어 자가항원에 대한 TCR 친화성 차이에 기인한 기능성의 차이를 규명하기 위한 시도가 있었다. 그러나 CD5lo 세포들에 의해 매개 되는 강한 염증반응의 원인을 밝히진 못하였고 다만, CD5hi 세포들의 우세한 조절 T 세포 (regulatory T cell)로의 분화 능력에 기인한 아집단들 간 병증 유도 차이 일 것이라 추측 할 뿐이었다. 뿐만 아니라 신생 CD8+ T세포 아집단들의 기능성차이에 대한 연구는 현재까지 외래 항원에 대한 반응만 연구되어 있을 뿐, 장염 상황에서의 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구는 CD8+ T세포의 TCR의 자가항원인식 상대적 강도 차이가 자가내성단절 조건에서 각 CD5lo, CD5hi T세포간에 어떠한 반응차이를, 어떠한 메커니즘을 통해 이끌어 내고 염증성 장염 발병에 기여하는지를 밝히고자 하였다. 기존의 선행연구들을 토대로 자가항원에 대한 TCR 친화도 정도에 따라 CD5lo, CD5hi 아집단을 우선적으로 구분 짓고, 선행 연구 조사를 통해 CD5hi 아집단 내에서도 표현형의 차이에 따른 기능적 이소성을 나타내는 아집단이 존재 함을 확인하였으며 기존의 CD5hi 세포에서 세포 표면의 Ly6C의 발현 유무를 기준으로 서로 다른 표현형질을 갖는 아집단으로 구분 지을 수 있었다. 이들 CD5hi 아집단들은 모두 그 표현형에서 기능적인 특성까지 명백한 차이를 보인다. 본 연구에서는 자가항원에 대한 TCR 친화도 정도와 사이토카인에 대한 반응성을 고려하여 CD5lo, CD5hiLy6C-, 그리고 CD5hiLy6C+ 세 아집단을 이용하여 염증성 장질환 발병의 차이와 그 기전에 대한 연구를 진행하였다. CD5lo 아집단의 가장 빠른 장염을 유도와 CD5hiLy6C+ 아집단이 염증 유도에 가장 뒤쳐짐을 확인 하였으며 이는 염증성 Tc17 세포의 분화적 차이와, 장간막 림프절로부터 장고유점막층으로의 이동 능력 차이에서 기인 함을 알 수 있었다 (Figure 1-2). 뿐만 아니라 수혜자 쥐의 면역 환경을 TLR3의 리간드인 poly I:C 주사를 통하여 감염증과 유사한 환경으로 바꾼 상황에서는 앞선 결과와는 정 반대로 CD5hiLy6C+ 아집단이 가장 우세한 장염 유도 능력을 보였다. 이는 아집단간의 분화적 특성에 기인한 것이 아닌, CD5hiLy6C+ 아집단의 폭발적인 분열에 의해 압도적인 염증성 Tc17 세포의 절대 수 증가에 의한 것이라 해석된다. 종합적으로 신생 CD8+ T세포 아집단들간 장염 유도 능력에 확연한 차이가 있으며 이는 염증성 Tc17 세포의 분화 정도와 이들 세포의 증식 정도에 따라 병증에 차이가 발생한다. 또한 본 실험결과들은 신생 CD8+ T세포 아집단들이 갖는 고유한 특성에 따라 생리학적 증상을 결정 짓는데 중요한 기능성 형성이 달라지며 이는 면역 환경에 따라 좌우 될 수 있음을 암시한다.

신생 CD8+ T세포 아집단들 간 어떠한 차이가 Tc17 세포로의 분화적 차이를 발생시키지를 알기 위해 먼저 Tc17으로의 분화를 저해시키는 요인들 중 가장 대표적인 IL-2에 의한 음성 조절의 차이에 기인한 것인지를 알고자 하였다. IL-2에 의한 음성 조절은 세 아집단들에 비슷하게 작용하고 있었으며, 이러한 음성 조절을 모든 아집단들이 강한 TCR 신호를 통해 극복 할 수 있음 을 알 수 있었다. 특히 CD5lo 아집단이 뛰어난 TCR 반응성을 통해 IL-2에 의한 음성 조절을 타 아집단들에 비해 잘 극복 함을 알 수 있었는데 이는 TCR 신호전달에 의해 유도 되는 여러 요인들 중 IRF4와 상관관계가 있으리라 여겨진다. 여러 선행연구들에서 TCR 신호에 의해 유도 되는 IRF4는 Th/Tc17 분화에 있어 필수 요소임을 밝힌 바가 있으며, 실제로 CD5lo 아집단의 뛰어난 IRF4 발현 유도와 더불어 IRF4의 직접적인 Rorc, Il17a 전사 조절 유전좌위의 결합 또한 우세함을 확인 하였다. 단클론 T 세포 아집단을 이용한 실험결과에서도 CD5lo 아집단이 우세한 Tc17 분화능력을 보임은 아집단 간 TCR 반응성 차이 이외, 다른 내제적 요인이 있을 수 도 있음을 암시 한다. Tc17의 분화 유도에 중요한 IL-6, TGF-β와 같은 사이토카인에 대한 반응성과 Tc17 분화의 상관관계를 분석해 보았을 때, Tc17 분화 정도와는 반대로 CD5hiLy6C+ 아집단이 뛰어난 사이토카인 반응성을 보임을 확인하였다. 최근 보고된 연구 결과에 따르면, 인산화 되지 않은 상태의 Smad3가 Rorc와 Il17a의 전사 유도를 억제 함이 밝혀졌다. 높은 수준의 Smad3가 CD5hiLy6C+ 아집단에서, 반대로 낮은 수준의 Smad3가 CD5lo 아집단에서 발현 됨 을 확인 하였으며, 초기 분화과정부터 분화가 끝나는 시점까지 Smad3의 Rorc, Il17a 프로모터 결합에 의한 Tc17 분화 억제가 CD5hiLy6C+ 아집단에서 우세함을 확인 하였다. 또한 Smad3의 과발현, 또는 전사 억제 유도를 통한 Tc17 분화 실험을 통해 아집단들 간 Smad3의 내제적 발현 차이가 이들간의 Tc17 분화 능력 차이를 만드는 주요한 요인 임을 알 수 있었다.

종합적으로 본 연구는 CD5lo, CD5hiLy6C-, 그리고 CD5hiLy6C+ 아집단들 간의 내제적 요인의 차이가 이들의 기능성을 결정 지으며, CD5lo 아집단이 갖는 뛰어난 TCR 반응성과 더불어 낮은 수준의 Smad3 발현이 장염 유도에 있어 중추적인 역할을 하는 Tc17 분화가 용이하게 만듦을 규명하였다.

Chronic inflammation in the gut is accompanied by the presence of Tc17 cells, and mechanistic studies on Tc17 cell generation have already been well-addressed. However, it is still unclear whether every unprimed naïve CD8+ T cell has the same capacity for Tc17 generation. Recent studies have shown that naïve CD8+ T cells are diverse and can be separated into different subpopulations that exhibit different functional properties. Such diversity originates from intrinsic differences in the strength of the interaction between the T cell receptor (TCR) with self-peptide-loaded major histocompatibility complex (self-pMHC), which governs the overall physiological behavior of T cells.

Since the level CD5 expression represents the intensity of the interaction between TCR and self-pMHC within individual T cells, many studies have focused on revealing the influence of intrinsic self-reactivity on the immune response of CD8+ T cells by comparing CD5-low (CD5lo) and CD5-high (CD5hi) cells. The main subset of colitogenic cells has been demonstrated by comparing the progression of colitis in naïve CD4+ CD5lo and CD5hi cells. CD5lo cells caused relatively severe inflammatory bowel disease (IBD), whereas the transfer of CD5hi cells or a mixture of CD5lo and CD5hi cells did not. Although the mechanism for this result has not yet been clearly addressed, this perspective suggests that different degrees of Treg generation might be correlated to the disease outcome. In contrast, the impact of the difference in the intrinsic self-reactivity of CD8+ T cells on Tc17-mediated colitis has received no attention.

A previous study showed an increase in the heterogeneity of CD5hi cells correlating with their enhanced foreign response. To investigate the differences in pathogenic potential among naïve CD8+ T cell subsets in a T cell-mediated chronic inflammatory bowel disease model, CD5hi cells were fractionated into CD5hiLy6C- and CD5hiLy6C+ cells according to their phenotypic heterogeneity and the physiological differences between naïve CD8+ T cell subsets, CD5lo, CD5hiLy6C-, and CD5hiLy6C+ cells, were compared by transferring them into individual Rag1-deficient mice. Transfer of CD5lo cells induced the strongest colitis onset with a massive destruction of crypts and an extensive loss of goblet cells compared to CD5hiLy6C- and CD5hiLy6C+ cells. Recipients of CD5hiLy6C- and CD5hiLy6C+ cells showed relatively mild symptoms, such as a lower T cell occupancy in the colon compared to their counterparts. Recipients of CD5hi cells, especially those that received CD5hiLy6C+ cells, showed outcomes comparable to those of the large intestine (LI) of PBS-injected control mice. The prominent migratory ability to the LI and the in vivo Tc17 polarization of CD5lo cells allowed them to induce stronger inflammatory responses in the LI than other subsets. In contrast, alteration of the immune environment in host mice via poly I:C injection resulted in superior colitis progression by CD5hiLy6C+ cells with explosive cell expansion, while CD5lo cells maintained prominent Tc17 polarizing capacity. Therefore, the different Tc17 generation of naïve CD8+ T cell subsets stem from inherently different self-reactivities of naïve CD8+ T cell subsets.

To understand the underlying mechanisms of distinct Tc17 generation from naïve CD8+ T cell subsets, each subset was cultured under Tc17-polarizing conditions (IL-6 + TGF-β). Prominent Tc17 generation was observed in CD5lo cells; otherwise, more Tc1 characteristics were found in CD5hiLy6C+ cells than in their counterparts, CD5lo and CD5hiLy6C- cells. In agreement with the suppressive role of IL-2 in Tc17 polarization, ablation of the IL-2 signal doubled Tc17 generation in all subsets; however, better Tc17 polarizing characteristics were detected in CD5lo cells, with a dramatically reduced IFN-γ production after blocking IL-2 signals targeting activated T cell-secreting IL-2 and IL-2Rβ. Unlike the negative regulation of IL-2 in the Tc17 polarizing program, strong TCR signaling is a key factor for successful IL-17A-producing T cell generation. Indeed, an increase in TCR signal strength allowed all subsets to overcome negative regulation via IL-2 signaling for Tc17 polarization. However, differences in Tc17 polarizing capacity among subsets did not change due to the prominent TCR response of CD5lo cells. It was found that such differences were closely related to intrinsic Smad3 expression levels. Overexpression and knockdown of Smad3 nearly nullified Tc17 differences among subsets, and such heterogenic Smad3 expression was correlated with self-reactivity in individual T cells.

Taken together, CD5lo cells are a potentially colitogenic subset of T cells because their prominent TCR responsiveness and relatively lower levels of intrinsic Smad3 allow them to have preferential Tc17 polarizing capacity together with a prominent migration ability towards the LI.