홍합수중접착 시스템에서의 표면접착력과 응집력 조절기작 연구

Abstract

Underwater mussel adhesion has been acquired numerous interests due to its versatility in tissue engineering and medical application area. Mussels use foot to make byssal thread and plaque. Plaque, which interacts to the surface directly, consists of ~19 proteins and 6 of them have been purified and characterized. The most significant in mussel adhesion is that interfacial proteins, locate at the interface between plaque and surface, have high portion of 3,4-dihydroxyphenylalanine (Dopa) which is a noncanonical amino acid hydroxylated from tyrosine, and most of underwater mussel adhesion studies have focused on Dopa residue. As a result, Dopa has been suggested as a multi-talented molecule which can participate to both surface adhesion and cohesion with various redox state and external conditions. From such understandings, successful materials have been reported in the tissue engineering and medical application area. Although many suggested materials that mimic Dopa to achieve underwater adhesion have shown successful results, we could not fully copy strong underwater adhesion of marine mussel. Because little is known about how to control the balance between surface adhesion and cohesion of Dopa which is crucial for achieving optimized overall underwater adhesion with the limited resources. I concentrated on the fact that little is known about mussel adhesion beside Dopa and dynamic interactions between foot proteins in different external conditions. Therefore, this dissertation describes about various factors that could affect the stance of Dopa (surface adhesion/cohesion) and contains insight about how to design systematic underwater bioadhesives in inter/intra macromolecule levels. In detail, for intra macromolecule level, I focused on other amino acid rather than Dopa. Lysine is also a major component of interfacial foot proteins. Interesting point of Lysine residues in interfacial foot proteins is that they often locate on right next to Dopa (~50% of Lysine has Dopa in neighbor). From this observation, I investigated Lysine-Dopa synergy in surface adhesion using surface forces apparatus (SFA). Synthetic peptides and re-designed recombinant protein were used to test the synergy. As a result, I confirmed the positive synergy of Lysine-Dopa pair on surface adhesion. Furthermore, I found that synergy comes from water displacement ability and charge bridge activity of Lysine residue. Next, I investigated on Lysine-Dopa pair effect in the aspect of Fe3+-mediated cohesion. As a result, I observed negative synergy for Fe3+-mediated cohesion, and I concluded that such anti-synergy comes from steric hinderance and electrostatic dispersion using ab initio density function theory (DFT) calculations. Cation-π interaction is noncovalent interaction which plays important role on various biological phenomena. Also, cation-π interaction participates in forming liquid droplets in the aspect of underwater mussel adhesion. I investigated amine-catechol pair effect on cation-π interaction. As a result, I observed negative synergy on cation-π interaction using SFA and Raman spectroscopy. Water displacement ability of adjacent amine changes local water molecule concentration, and this leads to the change the intensity of cation-π interactions. After studying about amino acids, I focused on other foot proteins which might have undefined roles on underwater adhesion. fp-6 is one of the interfacial foot proteins which has many Cysteine residues but few Dopa residues. I expected that fp-6 might play roles on controlling redox state of Dopa in interfacial proteins, therefore, the role of fp-6 has been tested using UV-Vis spectrophotometry. As a result, I confirmed that fp-6 affects the tautomer equilibrium of oxidized Dopa in interfacial proteins. Such phenomenon was also confirmed from SFA study. Next, I focused on fp-4 which has acidic part in its sequence, which is interesting because most mussel foot proteins are basic in physiological conditions. Therefore, I produced and purified acidic part of fp-4 (fp-4a) in bacterial expression system. I observed liquid droplets of fp-4a with fp-3F and fp-151 using UV-Vis spectrophotometry and optical microscopy (OM). Also, I observed Ca2+ binding ability of fp-4a using UV-Vis spectrophotometry, OM, and SFA. This dissertation describes how to control surface adhesion and cohesion in underwater mussel adhesion. Two major components were the target of this study: (1) amino acids and (2) proteins. I expect that my findings could give insight in designing underwater bioadhesives mimicking mussel adhesion and suggest clues on how mussels achieve successful underwater adhesion.

홍합은 강한 파도와 높은 염도를 갖는 바다환경에서도 강한 수중접착을 하며 살아간다. 이러한 점 때문에 수중접착 분야는 홍합의 접착기작에 대한 연구로 시작되었다. 그 결과 ‘도파’ 아미노산이 수중 접착에 중요한 역할을 한다는 점을 밝혀냈고, 이와 같은 발견을 바탕으로 도파를 이용한 수중접착은 다양한 조직공학분야와 의로소재분야에 널리 활용이 되었다. 제시된 여러 재료들은 각자의 분야에서 어느정도 성공적인 결과를 보여주었으나, 도파 만을 모방하여 제작한 재료들은 홍합의 강한 수중접착능력을 완전히 모사할 수 없었다. 홍합은 도파 뿐만 아니라 다양한 아미노산들과 여러 단백질들을 시간, 공간적으로 활용하여 수중 접착을 이루어내기 때문에 이러한 부분들에 대한 이해가 없이는 완전한 홍합의 수중접착 능력을 모사하긴 어렵다. 본 학위 연구는 도파 이외에 수중에서의 표면접착력과 응집력에 영향을 줄 수 있는 요소들에 대한 내용을 담고 있다. 크게 두 가지 관점에서 표면접착력과 응집력의 조절을 연구하였다. 첫 번째로는 아미노산 수준에서 도파 이외의 다른 아미노산이 도파와 표면접착단백질의 표면접착력과 응집력에 어떻게 기여하는지 알아보았다. 도파 이외의 아미노산으로는 표면접착단백질에서 높은 비중을 가지고 있는 라이신에 초점을 두어 관찰한 결과, 실제 표면접착단백질의 경우 라이신이 높은 비중을 차지한다는 점과 흥미롭게도 라이신이 자주 도파 바로 옆에 위치함을 알 수 있었다. 이러한 관찰을 바탕으로 라이신-도파 짝이 표면접착력에 어떤 영향을 미치는지에 대해 연구를 진행하였다. 표면힘측정기를 이용하여 나노미터 단위에서 분자간 인력을 조사한 결과 도파만 있을 때 보다 라이신이 바로 옆에 위치한 도파가 더 강한 표면접착력을 보여주었다. 추가로 이러한 시너지는 라이신이 도파와 붙어있을 때에만 활성화 되었으며, 한 칸 이상 떨어진 경우에는 작동하지 않았다. 또한 이러한 현상의 원인을 규명하기 위해 water magnetization NMR과 DFT계산을 이용하여 라이신-도파 시너지를 관찰하였다. 그 결과 이러한 시너지는 이웃한 라이신이 물을 더욱 잘 끌어당길 수 있음에 따라 도파 주변의 물과 표면의 물을 벗겨내어 도파가 접착표면과 직접적으로 상호작용할 수 있기 때문으로 밝혀내었다. 다음으로는 응집력에 대해 연구를 진행하였다. 응집력의 경우 홍합이 사용하는 두 가지 응집전략에 대해 라이신-도파 쌍의 역할을 알아보았다. 첫 번째로 철-매개 응집력에 대해 연구를 진행하였다. 그 결과 흥미롭게도 앞선 표면접착력과는 달리 라이신-도파 쌍이 철-매개 응집력을 방해하는 점을 표면힘측정기를 이용한 응집력 측정으로 알아내었다. 추가로 1D selective NOESY NMR과 DFT계산을 통해 원인을 분석한 결과 라이신의 아민기가 철 이온과 전기적 반발력을 형성하고 추가로 라이신의 긴 사슬이 공간적으로 철 이온의 접근을 방해하기 때문으로 확인되었다. 다음으로는 케타이언-파이 인력을 라이신-도파 쌍의 관점으로 연구를 진행하였다. 먼저 표면힘측정기를 이용하여 케타이언-파이 인력을 측정한 결과 철-매개 응집력과 마찬가지로 라이신-도파 쌍이 케타이언-파이 인력을 약화시킨다는 점을 알게되었다. 이를 라만분광기를 이용하여 분석한 결과 라이신의 물을 끌어당기는 능력이 도파 주변의 물 농도를 국지적으로 낮추고, 원래 케타이언-파이 인력을 안정화 시키는 물 분자가 적어 짐에 따라 전체적인 케타이언-파이 인력이 줄어든다는 점을 밝혀내었다. 두 번째는 단백질 수준에서의 조절을 연구하였다. 그 중 첫 번째로 fp-6단백질에 초점을 두고 연구를 진행하였는데, 6번 단백질의 경우 표면접착단백질들 중 하나이나 특이하게 도파를 많이 가지고 있지 않고 대신 시스테인의 함량이 높은 단백질이다. 이러한 점을 바탕으로 기존에는 6번 단백질의 항산화 작용에 대해 많은 연구가 진행되었다. 그러나 본 학위논문에서는 조금 다른 관점으로 산화된 도파의 토토머 평형에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각되어 연구를 진행하였다. 먼저 자외선-가시광선 분광기를 이용하여 6번 단백질이 표면접착단백질들 중 하나인 3번 단백질에 미치는 영향을 분석한 결과 높은 pH에서 응집력에 기여할 수 있는 도파퀴논이 3번 단백질만 있을 경우 대부분이었는데 6번 단백질을 함께 첨가한 경우 표면접착력에 기여할 수 있는 델타도파가 주된 분자임을 알 수 있었다. 추가로 표면힘측정기를 통해 실제 표면접착력이 늘어나는지와 도파퀴논이 없어짐을 알 수 있는 hardwall두께를 분석한 결과 앞선 자외선-가시광선 분광기에서의 결과와 일치함을 확인하였다. 두 번째 단백질로는 fp-4에 관심을 가졌다. fp-4의 경우 플락의 중심부에 위치한 단백질로서 acidic한 부분과 basic한 부분의 두 도메인으로 이루어져 있다는 특징이 있다. 이 중에서 본 학위논문은 acidic한 부분에 관심을 가졌는데, 그 이유는 대부분의 홍합접착단백질은 basic한데 코아서베이트 형성에는 acidic한 단백질이 있을 경우 유리하기 때문이다. 그렇기에 본 학위논문에서는 미생물을 이용한 재조합 단백질 발현 기법을 사용해서 4번 단백질의 acidic한 부분만 생산을 하여 특성을 조사해보았다. 자외선-가시광선 분광기와 광학현미경을 이용하여 관찰한 결과 4번 단백질의 acidic한 부분은 basic한 3번, 1번 단백질과 코아서베이트를 형성함을 확인하였다. 추가로 4번 단백질의 acidic부분은 칼슘이온과도 상호작용을 하였는데, 칼슘이온이 존재하는 경우 4번 단백질은 aggregate를 형성하였고 표면힘측정기로 상호작용을 조사한 결과 4번의 acidic부분은 칼슘이온을 매개로 응집력을 갖는다는 것을 밝혀내었다. 본 학위논문은 도파 이외의 요소들이 수중에서의 표면접착력과 응집력에 어떻게 기여할 수 있는지에 대해 연구를 진행하였고 본 학위논문에서 밝힌 점을 통해 지금까지와는 다른 더욱 효율적인 생체수중접착소재를 개발하는 데에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대 됨과 동시에 홍합의 수중접착비밀을 푸는 데에도 기여를 할 수 있을 것으로 기대한다.