Single-molecule analysis of mRNP and dynamics of CTIF on aggresome formation in living cells

Abstract

The translation process which converts genetic information into a specific amino acid chain is the source of all life phenomena and the most complex and sophisticated process. Numerous biochemical, structural, and genetic studies over the past few decades have broadened our understanding that the translation process occurs by more than 13 different factors and in what order. However, if we look into it more closely, we still have not been able to answer how the reactions determined by a stochastic process at every moment can occur so precisely. In this study, we extracted polysomes from cells and observed them using single-molecule fluorescence imaging to directly examine the “closed-loop” structure formed by the interaction of PABP, eIF4G, and eIF4E, which is called a representative model of the protein synthesis process. To this end, we developed a pull-down method using a streptavidin-binding peptide, and as a result, surprisingly, PABP, eIF4G, and eIF4E were not present together in endogenous mRNA being translated as well as mRNA containing m6A, which is known to form a loop structure better. This is contrary to the idea that a “closed-loop” would be formed if considering the intracellular concentration of proteins and their binding affinity. Furthermore, the ratio in which both proteins were present at the same time was also low. This suggests that the closed-loop structure is likely to be preferentially formed on non-translating mRNAs. Although it cannot be ignored that the performance of the antibody used in this study greatly influences the results, the single-molecule fluorescence technique tells us quantitatively what proportion of the translation-related factors is present in translating mRNA. This is a unique advantage of single-molecule systems not seen in ensemble experiments. Next, we counted the number of PABPs binding to the poly(A) through fluorescence imaging to find out how many PABPs participate in the translation. This is because, unlike eIF4E or eIF4G, PABP has the property of being able to bind multiple numbers according to the length of the poly(a). To this end, we first developed a DNA hanger system and made it possible to conduct high-concentration experiments with PABP, which has the property of sticking well to the surface, which was limited to experiments in conventional PEG-quartz. From the synthesized poly(A) RNAs with various lengths and recombinant mN-PABP, we investigated the number of PABPs binding to the specific length, the distribution was wider than expected. This result shows that long poly(A) does not always bind a high number of PABP, or short poly(A) does not always bind a small number of PABP, which is consistent with previous reports that the correlation between length and PABP occupancy is poor. Next, to investigate the correlation between translation efficiency and PABP occupancy we extracted the polysome and investigated the number of PABPs contained in a reporter mRNA. Interestingly, the median value was 2 in mRNA being translated and was 1 in mRNA in the translation preparation stage. Our result supports a model in which PABPs are attached to mRNA that undergoes active translation to protect mRNA from deadenylases and enhance translation efficiency. Finally, we observed the movement of CTIF in living cells using single-particle tracking to clarify that UPF1 plays a key role in the process of removing misfolded proteins that inevitably occur in the pioneer round of translation. Interestingly, CTIF is a protein that participates in the translation in the nucleus. However, most showed a directional movement into or out of an intracellular region called aggresome with the same speed as that of the dynein. This observation represents that the CED complex grabs the misfolded proteins and goes to the aggresome. Interestingly, the directional motion was inhibited when the intracellular UPF1 protein was depleted, and the aggresome was also poorly formed. Our result shows that UPF1 plays a key role in protein quality control. Overall, in this study, the single-molecule fluorescence imaging technique was used to understand the translation in more detail, and it is meaningful in that it reveals quantitatively heterogeneous characteristics that are difficult to know in the traditional ensemble experiments.

단백질이 만들어지는 번역 과정은 모든 생명현상의 근원이자 가장 복잡하고도 정교한 과정이기도 하다. 과거 수십 년간 우리는 수많은 생화학적, 구조적, 유전적 연구에 의해 우리는 번역 과정이 13개가 넘는 여러 인자에 의해 어떤 순서로 일어나는지 이해하게 되었다. 그러나 좀 더 자세히 그 안을 들여다 보게 되면 매순간 확률에 의해 결정되는 반응들이 어떻게 이렇게 정교하게 일어날 수 있는지에 대해 여전히 답을 내리지 못하고 있다. 본 연구에서 우리는 단백질 합성 과정의 대표적 모델이라고 불리는 PABP 와 eIF4G, eIF4E 의 상호작용으로 형성되는 “closed-loop” 구조를 직접 보고자 세포로부터 폴리좀을 추출하여 이를 단일 분자 형광 이미징 기법으로 관찰했다. 이 과정에서 스트렙타비딘 바인딩 펩타이드를 이용한 풀다운 방법을 개발했으며 그 결과 놀랍게도 모든 번역중인 메신저 RNA 뿐 아니라 보다 loop 구조를 잘 형성한다고 알려진 m6A 를 포함하고 있는 메신저 RNA 에서조차 PABP, eIF4G, eIF4E 가 함께 존재하지 않았다. 이는 “closed-loop”이 세포내 단백질 농도와 단백질 간 결합 세기에 의해 당연히 형성될 것이라 생각했던 것과는 상반되는 결과이다. 또한 심지어 두 단백질이 동시에 존재하는 비율도 낮게 나왔다. 이는 본 연구에서 보고자 했던 단백질이 번역개시인자이기 때문에 번역 신장과정에서는 메신저 RNA 로부터 분리되어 나타난 결과 일 수 있다. 비록 본 연구에서 사용한 항체의 성능이 결과를 크게 좌우한다는 점을 무시 할 수는 없지만 단일 분자 형광 기법은 실제 세포 내에서 번역과정중에 있는 메신저 RNA에 번역관련인자들이 어떤 비율로 존재하고 있는지를 말해준다. 이는 앙상블 실험에서는 볼 수 없는 단일 분자 시스템의 고유한 장점이다. 다음으로, 우리는 번역 과정에 과연 PABP가 어느 정도로 참여하고 있는지 알고자 형광 이미징 기법을 통해 메신저 RNA 의 3’폴리아데닌 꼬리에 붙어있는 PABP 개수를 세었다. 이는 PABP 가 eIF4E나 eIF4G와 달리 폴리아데닌 꼬리의 길이에 따라 여러 개 붙을 수 있는 특성을 지니기 때문이다. 이를 위해 우리는 먼저 DNA hanger 시스템을 개발했고 기존의 PEG-쿼츠 에서 실험에 제한이 되었던 바닥에 잘 들러붙는 성질을 지닌 PABP 의 고농도 실험을 가능하게 했다. 다음으로, 다양한 폴리아데닌 RNA를 합성하여 해당 길이에 붙는 PABP 수를 조사했을 때 그 분포가 생각보다 폭넓게 나타났다. 이는 길이가 길다고 항상 PABP 가 많이 붙어있거나 길이가 짧다고 항상 적은 PABP 가 붙어있는 것은 아니라는 점을 말해주는 결과이며 길이와 PABP 의 상관관계가 떨어진다라는 기존의 보고 와도 일치한다. 이어 번역 효율과 PABP 수의 상관관계에 대해 알아보고자 폴리좀을 추출하여 특정 메신저 RNA 에 들어있는 PABP 의 수를 조사했을 때 흥미롭게도 번역준비단계인 메신저 RNA 보다 번역 중인 메신저 RNA 에서 중간 값이 2로 1만큼 더 높게 나왔다. 이는 번역을 활발하게 하는 메신저 RNA에 PABP 가 많이 붙어 아데닌 소화효소로부터 메신저 RNA 를 보호하고 번역 효율을 증가시키는 모델을 지지하는 결과이다. 마지막으로 우리는 번역과정에서 필연적으로 발생하는 잘 못 만들어진 단백질들이 제거되는 과정에서 UPF1 이라는 단백질이 핵심적 역할을 한다는 점을 규명하고자 살아있는 세포에서 CTIF 의 움직임을 단일 분자 추적 기술을 통해 관찰했다. 흥미롭게도 CTIF 는 핵내 번역 과정에 참여하는 단백질이지만 실제 대부분 애그리좀이라 불리는 세포내 한 영역으로 들어가거나 빠져나오는 방향성을 지닌 움직임을 보였다. 이러한 움직임은 다이닌 모터 단백질과 동일한 속도를 지녔으며 번역 과정 중 잘 못 만들어진 단백질들을 CED 복합체가 붙잡고 애그리좀으로 간다는 사실을 보여주는 결과이다. 흥미롭게도 이러한 움직임은 세포내 UPF1 단백질을 없앴을 때 방향성을 잃고 저해되었으며 애그리좀 또한 잘 형성되지 않았다. 이는 단백질의 품질관리에 있어 UPF1 이 핵심적인 역할을 함을 보여준다. 종합적으로 본 연구에서는 단일 분자 형광 기법을 이용하여 번역 과정에 대한 이해를 한층 높이고자 했으며 기존 앙상블 실험에서는 보기 어려운 이질적인 특성을 정량적으로 알게 되었다는 점에서 의의가 있다.