Pathological mechanism and its reversibility of Linear Nevus Sebaceous Syndrome caused by dysregulation of RAS pathway

Abstract

Tumorigenesis and embryonic development share characteristic biological processes like cell proliferation, migration and differentiation. In fact, several genetic mutations in the RAS/MAPK pathway, which has a crucial role in tumor initiation and progression, have been reported in developmental disorders. These disorders are called "RASopathies". The common neurological manifestations of RASopathies are cerebral defects, developmental delays, intellectual disability, and epilepsy, suggesting the importance of the RAS/MAPK pathway in neurodevelopment. However, how the RAS/MAPK pathway is involved in neurodevelopment is not well understood. Linear nevus sebaceous syndrome (LNSS) is a neurocutaneous disorder caused by somatic gain-of-function mutation in KRAS or HRAS. Most of the identified genetic variants overlap with oncogenic mutations in KRAS or HRAS. Patients with LNSS showed severe neurological symptoms like cerebral defects, intellectual disability, epilepsy and developmental delay. However, how these oncogenic mutations in RAS lead to neuropathology in LNSS and their treatment potentials are largely unknown. For that, I established LNSS mouse model and human neuronal progenitor based cell model using KRAS p.G12V variant, one of the genetic mutation in LNSS. In the LNSS mouse model, I found that introduction of KRAS p.G12V into dorsal cortical progenitors is sufficient to recapitulate major patient histological manifestations like neuronal migration defects, gliosis and hypertrophic neurons. These results suggest that the hyperactive RAS signaling during corticogenesis causes cerebral defects in LNSS. Excitatory neurons with KRASG12V expression also showed hyperexcitability. Moreover, I found a decreased firing frequency of inhibitory neurons without KRASG12V expression, leading to a disrupted excitation and inhibition balance, which is possible pathological mechanisms underlying neurological symptoms in LNSS. Transcriptional profiling after destabilization domain-mediated clearance of KRASG12V in human neural progenitors and differentiating neurons revealed reversible functional networks underlying LNSS. Neurons expressing KRASG12V showed molecular changes associated with delayed neuronal maturation, and most of these changes were restored by KRASG12V clearance. These findings indicate some reversibility of neurodevelopmental defects in LNSS. Altered electrophysiological properties of KRASG12V expressing neurons suggest neuronal dysfunctions in LNSS. To study neuronal dysfunction caused by hyperactive KRAS and its potential reversibility in human neurons, I generated electrically active human neuronal models of LNSS using Ngn2-mediated neuronal differentiation. The mature LNSS neuron model reproduced delayed neuronal maturation, major neurodevelopmental defects in LNSS. This new established model will reveal the stage- specific role of RAS hyperactivation and treatment potentials of neuronal dysfunction in LNSS.

종양 발생 및 배아 발달은 세포 증식, 이동 및 분화와 같은 특징적인 생물학적 과정을 공유한다. 실제로 종양 형성 및 진행에 중요한 역할을 하는 RAS/MAPK 신호전달경로의 여러 유전자 돌연변이가 발달 장애에서 보고되었다. 이러한 발달 질환군을 "RASopathies"라고 부른다. RASopathies의 공통적인 신경학적인 증상은 뇌 결함, 발달 지연, 지적 장애 및 뇌전증으로, RAS/MAPK 경로의 신경 발달에서의 중요성을 시사한다. 그러나 RAS/MAPK 경로가 어떻게 신경 발달에 관여하는지에 대해서는 많이 알려져 있지 않다. 피지선 모반 증후군(Linear Nevus Sebaceous Syndrome)은 KRAS 또는 HRAS의 체세포 기능 향상 돌연변이에 의해 유발되는 신경피부질환이다. 환자에게서 식별된 대부분의 유전적 변이는 KRAS 또는 HRAS의 oncogenic mutation과 겹친다. 피지선 모반 증후군 환자는 뇌 결함, 지적 장애, 간질 및 발달 지연과 같은 심각한 신경 증상을 보인다. 하지만 RAS의 이러한 oncogenic mutation이 LNSS에서 신경병리를 어떻게 유발하는지, 이러한 병리의 치료 가능성은 보고된 바가 없다. 이를 위해 나는 KRAS p.G12V 변이를 사용하여 피지선 모반 증후군 생쥐 모델 및 인간 신경 전구 세포 모델을 구축했다. 생쥐 모델에서는 KRAS p.G12V를 대뇌의 등쪽 전구세포 (dorsal cortical progenitor)에 도입하는 것 만으로도 신경 이동 결함, 교세포화 및 비대한 신경세포 등과 같은 환자의 주요한 조직 병리를 재현하는 데 충분하다는 것을 확인했다. 이러한 결과는 대뇌 형성 과정 중의 과도한 RAS 신호가 LNSS에서 대뇌 기형을 유발한다는 것을 시사한다. KRASG12V를 발현하는 흥분성 신경세포도 과도한 흥분성을 보였다. 더 나아가, KRASG12V 발현을 하지 않는 억제성 신경세포의 활동 전위의 주기가 감소하는 것을 확인함으로써, 돌연변이를 가진 세포가 있는 대뇌 피질에서 흥분과 억제의 균형이 무너졌음을 확인하였다. 이러한 현상은 피지선 모반 증후군에서 보이는 신경 증상의 잠정적인 병리 기전이 될 수 있다. 인간 신경 전구세포 및 이로부터 분화시킨 신경세포에서 불안정화 도메인 (Destabilization domain) 매개에 의한 돌연변이 단백질(DD-KRASG12V)의 안정성을 조절하여 전사체 분석을 하였을 때, 나는 돌연변이 단백질의 조절에 의한 가역적인 LNSS의 기능적 네트워크를 확인하였다. KRASG12V를 발현하는 신경세포들은 지연된 신경 성숙과 관련된 분자적 변화를 보여주었고, 이러한 변화 중 상당 부분은 돌연변이 단백질의 제거에 의해 회복되었다. 이러한 결과는 피지선 모반 증후군에서의 신경 발달 결함의 일부가 가역적임을 시사한다. KRASG12V를 발현하는 신경세포의 전기생리학적 특성 변화는 피지선 모반 증후군 신경 세포에서 기능 이상이 발생했음을 의미한다. 과도한 KRAS 활성에 의해 유발되는 신경 기능 이상과 이 가역성을 연구하기 위해 나는 Ngn2 유도발현에 의한 직접 신경 분화 유도 방법을 사용하여 전기적 활성을 보이는 인간 피지선 모반 증후군 신경세포 모델을 만들었다. 이 모델은 주요 신경 발달 결함인 지연된 신경 성숙을 재현하였다. 이 새로운 모델을 기반으로 RAS의 과도한 활성화의 발달 시기 별 역할과 피지선 모반 증후군에서의 신경 기능 이상의 치료 가능성을 밝혀낼 수 있을 것이다.