바이오 리파이너리를 위한 해조류 다시마의 생물학적 전처리와 이 과정에서의 미생물 군집 변화

Abstract

화석연료의 과다한 사용으로 지구온난화와 연료의 고갈의 문제에 현대사회는 직면해 있다. 이를 해결하기 위한 일환으로 CO2를 저감 시킬 수 있는 광합성으로부터 생산된 바이오매스를 에녀지원으로 이용하여 재생 가능한 바이오 연료를 생산하는 바이오리파이너리 시스템에 대한 연구와 관심이 급증 하고 있다. 최근 주목 받고 있는 바이오매스 중 해조류는 생산 잠재력이 높고 당 함량도 높지만 전분질계나 목질계와 비교했을 때 차이를 갖고 있어 적합한 바이오리파이너리 생산 시스템을 개발하는 것이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 해조류의 바이오매스로 적용한 바이오리파이너리 생산 공정을 설립하기 위해 갈조류 중 우리나라에서 가장 많이 수확되고 있는 다시마를 연구에 적용하여 고부가가치 산물을 생산하기 위한 기질생산의 일환으로 생물학적 연속 당화 생산 시스템을 완성하고자 하였다. 시스템 운영을 위해 다시마는 영양분과 전처리 없이 건조다시마와 수돗물을 균일하게 섞어 고상과 액상을 분리하고 만니톨이 가용화된 액상부분을 제외한 다당류가 고농도로 농축된 고상 바이오매스를 제조 후 공정 시스템의 기질로써 연속적으로 주입하였고 호기발효를 통해 당화액을 생산하기 위해 이전 연구에서 개발된 해조류 유래 유기산 반응조의 혼합균주를 호기조건과 고상 기질에서 진탕배양하여 본 반응조에 접종 후 멸균 처리 없이 127 일간 연속적으로 안정되게 운전하였다. 연속 공정 시스템 최적화에 앞서 고상 바이오매스를 회분식 생물학적 전처리 공정에서 수행 시 36시간에서 20.73 g/l로 가장 높은 가용화 당량을 얻었으며 환원당 또한 1.42 g/l의 측정치를 얻었다. 물리적 화학적 전처리에서 가장 높은 가용화 당량 조건에서의 측정치와 비교해 볼 때, 1.23배 높은 가용성 탄수화물과 1.27배 높은 환원당을 수득할 수 있었다. 혼합균주를 이용한 생물학적 전처리 방법이 고농도의 고상으로부터 기존의 물리적, 화학적 전처리 보다 1.23배 높은 가용성 탄수화물과 1.27 배 높은 환원당을 수득하여 생물학적 회분식 전처리에 의해 높은 수율의 당량을 얻을 수 있음이 확인되었다. 회분 공정을 기반으로 연속식공정에서 수리학적 체류 시간을 4일부터 순차적으로 2일, 1일, 0.5일로 낮추어 가며 최적의 당화가 이루어지는 시점을 확인하였다. 수리학적 체류시간을 4일로부터 수리학적 체류시간을 절반씩 낮출수록 당화는 점차 증가하는 양상을 보였다. 연속식공정을 수행했을 때 1일의 수리학적 체류시간 조건에서 당화의 효율이 최고 시점을 이루었으며 반응기가 안정화된 후 17.96 g/L/day의 가용화된 탄수화물과 4.30 g/L/day의 환원당을 수득하였다. 또한 기존의 물리적, 화학적 전처리 대비 1.08배 높은 가용성 탄수화물과 3.84배 높은 환원당을 수득함으로써 생물학적 연속 전처리에 의해 연속적으로 높은 수율의 당량을 얻을 수 있음을 확인 할 수 있었다. 하지만 수리학적 체류시간을 0.5일로 낮추었을 때 반응기로 유입되는 고상 바이오매스의 당화효율이 급격히 떨어지는 현상을 확인할 수 있었다. 이것은 유입되는 고상 바이오매스가 미생물에 의해 분해되는 당화 속도보다 빠르며, 빠르게 유출되는 전처리 산물 중에 당화에 관련된 미생물이 다수 포함되어 있음을 예상할 수 있다. 그리고 밀도 높게 유입되는 고상 바이오매스에 의해 부분적 혐기가 발생하고 이로 인해 생성되는 유기산에 의해 급격하게 낮아지는 pH에 의해 당화에 관련한 미생물이 영향을 받았음을 예상할 수 있다.이러한 현상학적 결과를 바탕으로 반응기 내부의 조건 변화에 따른 군집구조의 변화를 확인하기 위해 DGGE 그리고 454-pyrosequencing기법을 이용해 군집분석을 수행한 결과, 다양한 미생물들이 수리학적 체류시간의 변화에 따라 생성되거나 소멸되기도 하는 것으로 확인되었다. 반응조 내의phylum레벨에서 proteobacteria가 98%이상 주를 이루고 있으며 HRT0.5day에서 준 혐기성 미생물인 firmicutes를 확인할 수 있었다. 이는 HRT 0.5day에서 부분적 혐기가 일어났음을 예상할 수 있는 결과이다. genus레벨에서 미생물의 군집변화 양상을 확인해 보았을 때 초기 접종균의 경우 klebsiella (79.4%), Unclassified Enterobacteriaceae (12.59%)가 주를 이루었지만 연속당화공정을 시작한 HRT 4day에서 Paracoccus (51.7%), Sphingomonas (21.2%)로 군집이 변하였으며 기질 부하량을 2배로 증가시킨 HRT2day에서 Raoultella (49.0%), Unclassified Enterobacteriaceae (45%)로 기질 부하량의 변화에 따른 미생물 군집의 다이나믹한 변화양상을 확인 할 수 있었다. 그리고 당화생산이 최적을 이룬 HRT 1 day에서 당화에 관여하는 대표적인 균주는 Unclassified Xanthomonadaceae (89.75%)로 확인되었으며 DGGE로써 종을 확인하였을 때 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 임을 확인 할 수 있었다. 또한 당화효율이 급격하게 떨어진 HRT 0.5day에서 Acetobacter (40.9%), Enterobacter (31.8%)가 확인되었으며 이것은 임계이상의 기질의 유입으로 인해 부분적 혐기가 일어났으며 그로 인해 다량, 다양한 종류의 산 생성으로 당화와 관련된 미생물의 군집이 pH의 조건변화에 의해 급격한 변화가 일어났음을 확인할 수 있었다. 결론적으로 해조류로부터 기존의 물리화학적 전처리방법과 달리 생물학적 전처리를 수행하여 당화의 생산 효율을 검증함으로써 연속 생물학적 전처리 공정개발의 가능성을 확인했다. 또한 회분(Batch), 연속회분(Repeated-Batch), 연속(CSTR)공정을 도입하여 전처리 효율의 최적화를 수행함으로써 해조류 고상바이오매스의 저비용, 친환경, 고효율의 당화를 이루었다. 또한 생물학적 전처리에 있어 영향을 주는 미생물들의 군집양상을 확인함으로써 생물학적 전처리의 풀플랫폼을 이룰 수 있는 기반을 마련하였다. 연속적으로 생산된 당화액을 바이오매스로 이용하여 고부가가치 바이오기반 화학물질 및 재생 가능한 에너지와 같은 바이오리파이너리를 생산할 수 있을 것으로 기대한다.

3rd generation biomass has paid more attention as a potential resource for the production of renewable biofuels and other chemical compounds. Laminaria japonica is a well-known as representative brown algal biomass which has characteristics of high productivity, cheap cost, and high carbohydrate content accounting for approximately average 65% (w/w) of dried biomass weight as well. L. japonica is mainly consist of these carbohydrates such as mannitol, laminaran, fucoidan, and alginate. Among these, carbohydrate polymers alginate and mannitol are the major components accounting for approximately 50% (w/w) of total carbohydrates. Especially, mannitol is easily solubilized in liquid-phase. However, alginate and larminaran are present in the solid-phase of mixture of L. japonica which is water-insoluble polysaccharide so that its direct fermentation is usually difficult and it also requires a high HRT for production. Biological pretreatment using various microbial consortium investigated to produce fermentable saccharides from carbohydrate polymers of solid-phase of L. japonica, which their performances were confirmed in aerobic CSTR operation system. A biological saccharification system has been established by inoculating enrichment of mixed aerobic microbial consortium obtained from a previous study, volatile fatty acid producing reactor, and operated in a continuous mode for over 127 days by feeding non-sterile suspension of solid phase of kelp in tap water without additional nutrients supplies, monitoring pH. Production of including soluble carbohydrate, reducing sugar were observed of which the profiles with each of HRT condition and saccharification yields were dependent to the change of HRT: Efficiency of saccharification was increased according to the decrease .during HRT 4day, 2day, and 1day. While, HRT 0.5day was dramatically decreased of saccharification yield. The maximum saccharification yield was as high as 17.96 g/L/day soluble carbohydrate, 4.30 g/L/day reducing sugar, respectively at HRT 1day. The comparative analyses by DGGE and barcoded pyrosequencing of mixed microbial consortium about biological pretreatment provided information on the profiles of microbial population change during the operation of the CSTR. Along with the changes of monitoring of pH and substrate loading rate, major dominant microbes contributed to changed efficiency of saccharification: Proteobacteria was the most abundant 98.42% of total bacteria at HRT 1day that was the highest yield conditions of saccharification, the genus of unclassified Xanthomonadaceae (89.75%) was mainly composed. There microbial consortium was confirmed by DGGE which identified as Xanthomonas oryzae pv. oryza. A majority of microbes were identified as various polysaccharide hydrolytic microbes at HRT 4day, 2day, and 1day. While, highly related various acid production microbes were increased at HRT 0.5day. Detected Acetobacter (40.9%) which was known that a particular anaerobic fermentative microbe producing various volatile fatty acids (VFAs) from sugar. It was considered that various microbial consortiums can affect the decrease yield of saccharification with more produced VFAs according to pH changes.We successfully demonstrate a continuously biological pretreatment process using a mixed cultivation system for saccharification from brown algal biomass and suggest compatibility of this noble biological pretreatment process which is promising to improve biorefinery production and contribute to establish of full platform of biorefinery technology for using combined resource about renewable, non-polluting biorefinery production in future.