식물의 카드뮴 저항성에 기여하는 두 종류의 Heat Shock 전사조절자와 Metallothioneins에 대한 연구

Abstract

카드뮴은 전 세계적으로 광범위하게 토양 및 수질을 오염시키고 있는 유독한 중금속이다. 그것이 세포 내로 들어오면 활성 산소를 유도하여 세포에게 손상을 입힌다. 카드뮴으로 오염된 토양에서 자란 식물과 그들을 먹고 사는 동물들은 심각한 질병에 걸릴 수 있다. 그래서 본인은 카드뮴으로 오염된 토양에서 잘 견디는 식물 뿐만 아니라 카드뮴을 적게 흡수하는 작물을 개발하기 위한 유전자 발굴 프로젝트를 시작하였다. 사용한 방법은 밀에서 얻은 cDNA library를 카드뮴에 민감한 효모에 발현시켜, 살아 남는 콜로니를 찾는 기능보완 (functional complementation) 스크리닝 이었다. 이 방법으로 찾은 유전자 중에서 Class A4 heat shock transcription factor와 상동성이 높은 transcription factor TaHsfA4a (Triticum aestivum Heat Shock Transcription Factor A4a)라 명명하고 이 유전자의 특성과 카드뮴 저항성에 대한 작용 메커니즘을 연구했다. 이 유전자는 392개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 앞 부분에 DNA binding domain을 가지고 있고 중간 부분에 핵으로 갈 수 있는 시그널이 있어 GFP를 이용한 세포 내 위치 관찰에서 핵에 존재한다는 것을 관찰했다. 또한, 벼에서 TaHsfA4a와 비슷한 두 유전자를 찾았는데 85.7% 상동성을 갖는 OsHsfA4a (Rice Heat Stock Transcription Factor A4a)와 70.1% 상동성을 갖는 OsHsfA4d (Rice Heat Stock Transcription Factor A4d)를 찾았다. 이들을 카드뮴에 민감한 효모에 발현시켜 효모의 성장을 관찰한 결과, OsHsfA4a는 카드뮴 저항성을 보이는 반면에 OsHsfA4d는 그렇지 못했다. 이러한 차이를 이용하여 이들간의 DNA binding domain을 비교 분석하고 아미노산 서열이 크게 다른 부분을 돌연변이 시켰고, 그 결과로 DNA binding domain이 카드뮴 저항성을 높이는데 중요한 역할을 한다는 것을 알아냈다. 특히, 두 개의 아미노산 치환 실험을 통해 DNA에 붙는 위치보다 다른 단백질과 결합하는 부분이 더 중요하다고 추론했다. 이들 카드뮴 저항성 전사조절 단백질들이 어떤 유전자들의 전사를 조절하는지를 알아내기 위해 효모에서 microarray 실험을 수행하여, TaHsfA4a에 의해서 발현이 증가되는 170개의 단백질을 찾았으며, 그들 중 스트레스에 관여하는 유전자들의 복합적인 발현이 카드뮴 저항성에 기여했을 것으로 추정하였다. 특히, 구리와 카드뮴을 잘 잡는다고 보고된 metallothionein (MT) 계열의 CUP1 유전자가 TaHsfA4a의 직접적인 조절을 받아 카드뮴 저항성에 기여했다는 사실을 증명했다. 이러한 효모에서 검증된 기능을 모델 식물인 벼에서 알아보기 위해 TaHsfA4a 과발현 벼와 OsHsfA4a 저발현 벼를 이용하여 카드뮴이나 다른 중금속에 대한 저항성을 테스트 해 보았다. 그 결과 TaHsfA4a 과발현 벼는 야생종에 비해 카드뮴에 대한 저항성을 보였고, OsHsfA4a 저발현 벼는 야생종에 비해 민감한 표현형을 보였다. 이것은 HsfA4a 유전자가 카드뮴 저항성에 기여하고 있다는 것을 식물에서 증명한 것이다. 더 나아가 벼와 밀에서도 효모에서와 같이 MTs이 HsfA4a의 조절을 받을까 조사해 보았다. 예상대로 벼와 밀 모두에서 HsfA4a의 발현이 증가하는 조건에서 MTs의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, 뿌리에서 카드뮴에 의한 TaHsfA4a와 OsHsfA4a의 발현이 증가되면 TaMTs와 OsMT의 발현도 함께 증가하였다. 이것은 효모에서 뿐만 아니라, 벼와 밀에서도 HsfA4a에 의해 유도된 MTs 유전자가 카드뮴 저항성에 기여했다는 것을 말해 주고 있는 것이다.MTs는 cysteine을 많이 가지고 있는 작은 단백질로서 동물에서부터 식물에 이르기까지 고등생물에 여러 형태로 존재하며, metal chelation과 ROS degeneration에 대한 연구가 보고되었다. 본 연구에서는 애기장대의 protoplast와 Vicia faba의 공변세포를 이용해 AtMT2a와 AtMT3의 카드뮴 저항성 기능을 밝혔다. 이들은 항상 세포질에 존재하였으며 세포 내로 들어온 카드뮴을 잡아 줌으로써 카드뮴에 의해 발생되는 활성 산소를 줄여 카드뮴을 무독화시키는 역할을 했다. 이렇게 카드뮴 저항성에 기여하는 유전자를 조절할 수 있는 전사조절자를 찾은 것은 대단히 중요한 일이다. 이러한 전사조절자들은 중금속 스트레스에 관련된 여러 유전자를 복합적으로 조절하기 때문에 이들을 이용하면 한 유전자만 과발현 시켰을 때 보다 훨씬 큰 시너지 효과를 얻어낼 수 있을 것이다. 더욱이 동물에서 잘 알려진 중금속 저항성에 중요한 전사조절자 Metal response transcription factor 1 (MTF-1)은 식물에서 발견되지 않았다. 그러므로 본인은 본 연구에서 찾은 HsfA4a가 식물에서는 MTF1의 기능을 대신 하고 있을 가능성이 있다고 생각한다. 왜냐하면, 식물에는 동물보다 훨씬 다양한 Hsfs 유전자들이 군집을 형성하고 있고, 이렇게 다양한 Hsfs은 각각 고유의 기능으로 진화되었을 것이기 때문이다. 본인은 이 연구를 통하여 HsfA4a 유전자를 유용한 작물에 적용하여 중금속으로 오염된 토양에서도 잘 자라고, 중금속 흡수를 막아 작물 내에 중금속 함량을 최소화 할 수 있는 안전한 작물을 만들 수 있을 것으로 기대한다.

Cadmium (Cd) is a widespread soil pollutant in industrial and agricultural areas. Plants have mechanisms that confer tolerance of this toxic metal

however, the underlying molecular controls and tolerance genes have not been well characterized.A screen of wheat genes that confer Cd tolerance to a Cd hypersensitive yeast strain resulted in the identification of a heat shock transcription factor (Hsf), Triticum aestivum Heat shock transcription factor A4a (TaHsfA4a). Based on predicted amino acid sequences, TaHsfA4a is most similar to the class A4 Hsfs from monocots, including barley, sorghum, maize, and rice. The most closely related rice homolog, OsHsfA4a, conferred Cd tolerance in yeast, as did TaHsfA4a, while the second-most closely related rice homolog, OsHsfA4d, did not. Cd tolerance was enhanced in rice plants expressing TaHsfA4a, and decreased in rice plants with knocked-down expression of OsHsfA4a. An analysis of the functional domain using chimeric proteins constructed from TaHsfA4a and OsHsfA4d revealed that the DNA-binding domain (DBD) of TaHsfA4a is critical for Cd tolerance. A detailed analysis of the DBDs revealed that, within this region of TaHsfA4a, Ala-31 and Leu-42 are important for Cd tolerance. I searched for the targets of TaHsfA4a and found that the TaHsfA4a-mediated Cd resistance mechanism requires metallothionein (MT) in yeast. Thus I hypothesized that TaHsfA4a confers Cd tolerance by regulating MT gene expression in plants as well. In line with this hypothesis, Cd stress caused increases in TaHsfA4a and OsHsfA4a expression, together with their target MT genes, in the roots of wheat and rice. These findings suggest that the two class A4 Hsfs of wheat and rice confer Cd tolerance by up-regulating MT gene expression in planta. Furthermore, the Arabidopsis MT genes AtMT1 and AtMT2 confer Cd resistance to Cd-sensitive yeast, but it has not been directly shown whether they or other MTs provide the same protection to plants. I tested whether AtMT2a and AtMT3 can confer Cd resistance to plant cells by introducing GFP- or RFP-fused forms of the genes into guard cells of Vicia faba by biolistic bombardment. AtMT2a and AtMT3 protected guard cell chloroplasts from degradation upon exposure to Cd, an effect that was confirmed using an FDA assay to test the viability of the exposed guard cells. AtMT2a- and AtMT3-GFP were localized in the cytoplasm both before and after treatment of V. faba guard cells or Arabidopsis protoplasts with Cd, and the levels of reactive oxygen species were lower in transformed guard cells than in non-transformed cells after Cd-treatment. These results suggest that the Cd-detoxification mechanism of AtMT2a and AtMT3 may not include sequestration into vacuoles or other organelles, but does involve reduction of the level of reactive oxygen species in Cd-treated cells. In Arabidopsis seedlings exposed to Cd, the expression of AtMT2a and AtMT3 increased. Together, these data support a role for the metallothioneins AtMT2a and AtMT3 in Cd resistance in intact plant cells. In summary, I identified two new transcription factors and their target gene metallothionein as important factors in cadmium resistance of plants.