16S rDNA 기반의 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용한 병원성 미생물 동시 검출

Abstract

병원성 원인균들은 심각한 전염병을 유발하여 인류의 복지와 건강에 커다란 위협을 줄 수 있기 때문에 질병 예방을 위한 병원성 미생물의 사전 검출 기술은 중요한 연구 개발 분야이다. 1882년 로버트 코흐가 결핵의 원인이 유전이나 영양실조가 아닌 결핵균이라는 것을 밝혀낸 이후 100 여년이 지난 지금까지도 병원성 미생물 검출을 위해 그의 실험 방법을 사용하고 있다. 그 후 분자생물공학의 발전에 힘입어 핵산, 단백질, 당과 같은 생물분자들을 이용하여 배양에 의존하는 기존 방법을 뛰어 넘는 빠르고, 민감하며 정확한 병원성 미생물 검출 방법을 개발하기 위한 수많은 연구들이 진행되었다. 배양에 의존하기 때문에 검출 시간이 오래 걸리는 기존 방법의 단점들을 극복하고 고효율의 검출이 가능한 해결책 중의 하나는 바로 디엔에이 마이크로어레이다. 그 중에서도 특히 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 빠르며 동시 분석이 가능하고 고효율로 단일염기변형 (SNP)까지 구별할 수 있기 때문에 다종 동시검출시스템의 구현에 적합한 특성을 보인다. 이 연구에서는 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 이용한 다종의 병원성 미생물들의 효율적인 검출을 수행하기 위해 (1) 합성된 모델 검체와 실제 균주를 이용한 검체를 통한 두 단계의 실험, (2) 16S rDNA 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이의 개선을 통한 진화, (3) 16S rDNA의 특이적인 탐침을 이용한 아종 구별을 위한 패턴 인식형 분석 방법, (4) 제작된 16S rDNA 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이의 실제적인 적용을 위한 16S rRNA의 직접 검출법을 개발 등의 여러 전략들을 수립하고 실험을 통해 그 유효성을 확인하였다.첫째로 대장균 K12를 대조군으로 하는 7 종의 병원성 미생물의 다중 확인을 위해서 새로운 올리고뉴클레오티드 기반의 검출 마이크로어레이를 디자인하고 제작하였다. 16S rDNA의 각 균주에 대한 독자적인 염기서열을 가지는 첫 번째 가변 영역에서 특이 검출 탐침들을 전략적이고 최적으로 디자인하고 제작하였다. 합성된 모델 검체는 16S rDNA의 첫 번째 보존 영역과 가변 영역 양쪽을 담고 있으며 이를 이용하여 마이크로어레이의 검출 능력을 검증하였다. 합성 모델 검체를 이용하여 결정된 실험 조건에서 병원균 염색체의 16S rDNA를 비대칭 증폭한 실제 검체로 마이크로어레이의 검출 능력을 확인하였다. 새로운 마이크로어레이 시스템에서 실제 검체를 이용한 검출 실험은 성공적으로 수행되었고, 합성 모델 검체에 비해 더 나은 특이성을 보였다. 더욱이 비브리오 병원균의 아종들이 성공적으로 분류되었다. 또한 염기 서열 정보의 불일치 데이터를 기반으로 하는 합리적인 분석 방법을 통해 제작된 검출 탐침의 특이성은 불일치하는 염기서열의 숫자와 위치에 따라서 달라질 수 있다는 것을 발견하였다. 거기에 검출 시그널의 차이가 유효한지를 확인하기 위해서 통계적인 유의 확률 (p-value) 기준을 도입하였다.다음으로 11 종의 선택된 병원성 미생물들의 더 효율적이고 정확한 다종 검출을 수행하기 위해서 16S rDNA의 전체 가변 영역을 사용한 2개의 특이 검출 탐침을 가진 개선된 16S rDNA 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 제작하였다. 그 결과 이전에 제작된 2차원 시각화 도구를 이용하여 특이 검출 탐침와 검체의 특이적 결합을 기반으로 병원성 미생물의 유무를 검출하는 분석 방법으로 7 종의 병원균들을 특이적으로 검출하였다. 그러나. 높은 염기 서열 유사성을 가지는 16S rDNA에서 유래한 특이 검출 탐침의 비특이적 결합으로 인해 몇 종의 검사 균주들과 아종들은 위 분석 방법으로 구별되기 어렵다. 각 균주들의 특이적 결합의 마이크로어레이 패턴을 분석하던 중 2차원 그림에서 균주마다 패턴이 조금씩 다르다는 것을 발견하였다. 이를 이용하여 계통학적으로 가까운 병원균들 사이의 마이크로어레이 패턴의 미묘한 차이를 구별하기 위해 반복 실험 데이터에 의해 훈련된 인위적 신경회로망 알고리즘을 이용한 패턴 사상 모델을 확립하였다. 패턴 사상 분석 도구와 연계한 두 개의 특이 검출 탐침을 가진 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 시스템은 강한 비특이적 결합을 보이는 유사한 염기 서열을 가진 두 균주의 아종을 포함하는 모든 검사 병원균들을 성공적으로 검출할 수 있었다. 종합적으로 이 실험 결과는 우리의 16S rDNA 기반의 디엔에이 마이크로어레이와 패턴 사상 분석 도구의 새로운 결합 시스템은 간단하고 효과적으로 다종의 병원균을 검출하는 방법이라는 것을 보여준다. 정량적인 데이터 분석은 엠알엔에이 발현 양상과 병원균의 감염량의 측정을 포함하는 디엔에이 마이크로어레이의 여러 적용 분야에 있어서 핵심적인 요소이다. 여기서 우리는 올리고뉴클레오티드 칩의 모델 시스템을 이용한 정량적 병원성 미생물 검출을 위해 인위적으로 제작된 표준 탐침을 사용하는 전략을 이용하였다. 표준 탐침의 염기 서열은 검사 미생물과 비특이적인 반응을 일으키지 않도록 디자인되였다. 표준 탐침의 형광 시그널을 이용하여 특이 검출 탐침의 원래의 형광 시그널을 보정한 후 검체의 농도에 따른 형광 시그널의 선형적인 관계를 확인할 수 있었다. 그러므로 새로운 표준 탐침 전략은 칩간의 편차를 보정하고 한 가지 형광 염료로 표지된 디엔에이 마이크로어레이 시스템의 정량적인 데이터 분석을 위해 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 보인다.마지막으로 제작된 16S rDNA 마이크로어레이의 실제적인 적용을 위해 우리는 16S rRNA을 기반으로 하는 직접 검출 전략을 도입하였다. 추가적인 반응이나 정제 과정 없이 비대칭으로 증폭된 디엔에이 검체와 정제된 전체 알엔에이 검체 그리고 세포 용혈을 통한 전체 알엔에이 검체가 특이 탐침과 형광 염료로 표지된 검출 탐침 둘 다와 직접 혼성화 반응하였다. 특히 세포 용혈에서 얻은 알엔에이 검체를 이용한 실험에서 모든 병원성 미생물들이 특이 검출 탐침와 검체의 특이적 결합을 기반으로 병원성 미생물의 유무를 검출하는 분석 방법으로 분명하게 확인되었고, 기존의 16S rDNA 검체를 이용한 실험보다 더 나은 특이성을 보였다. 직접 검출법의 민감도는 다른 보고된 연구 결과에 비해 102-103배 정도 높았다. 거기에 음식 샘플에 직접 검출법을 적용한 결과 음식샘플이 없었던 실제 균주를 적요한 실험과 비슷한 수준의 형광 시그널과 민감도를 보여주었다. 결과적으로 이 연구 결과는 우리의 새로운 16S rDNA 기반의 올리고뉴클레오티드 칩을 이용한 검출 시스템으로 다종의 병원성 미생물들을 성공적으로 검출할 수 있으며 빠르고 간편한 검출원리 추가를 통해 음식이나 임상에서 검출해야 하는 많은 다른 미생물을 동시에 검출할 수 있는 시스템으로 확장될 수 있음을 보여준다.

Pathogen detection is an important issue in human health due to the threats posed by severe communicable diseases. Since pathogens have been scientifically detected by Koch？s postulation so-called conventional methods over 100 years in company with advance of molecular biology, numerous attempts have been made to develop rapid, sensitive, and accurate techniques for detection and diagnosis of pathogenic bacteria using biomolecules such as nucleic acids, proteins, and glycans. To overcome the limitations of conventional methods and accomplish high-throughput detection, one possible solution is DNA microarray, especially, oligonucleotide microarray which has many advantages of fast, simultaneous, and high-throughput detection and discrimination of single nucleotide polymorphism. Here, to achieve efficient detection of multiple pathogens using oligonucleotide microarray, we elaborated several strategies

1) two-step experiments using model and real targets, 2) improvement of 16S rDNA oligonucleotide microarray, 3) pattern-mapping analysis for subtype discrimination using specific probes of 16S rDNA, 4) artificial standard strategy for quantitative detection, and 5) direct detection using 16S rRNA for practical application. Firstly, novel oligonucleotide-based signature microarray was designed for multiple identification of seven selected pathogens with Escherichia coli K12 as a control. Specific capture probes were strategically and optimally designed from the characteristic first variable region of the 16S rDNA sequences. This array was verified using synthesized model targets comprising both conserved and variable regions of 16S rDNA. Under conditions established through experiments with model targets, we confirmed the validity of the signature chip system using real target 16S rDNA probes generated by asymmetric amplification of pathogenic chromosomes. Detection with real target probes was successfully performed using our system, and better specificity was obtained compared to experiments with model targets. Moreover, the subtypes of Vibrio pathogens were successfully classified. Through rational analysis of data based on mismatch sequence information, we found that the factors responsible for specificity of the designed capture probes included mismatch number, position, and sequence. In addition, for identification of statistical difference, the statistical p-value criterion was included. Next, to achieve more efficient and accurate multiple detection of eleven selected pathogenic bacteria, we constructed an advanced 16S rDNA oligonucleotide microarray containing doubly specific capture probes. As a result, seven target pathogens were specifically detected by the microarray with the aid of traditional perfect match-based analysis using our previously proposed two-dimensional visualization plot tool. However, some target species or subtypes were difficult to discriminate by perfect match analysis due to nonspecific binding of conserved 16S rDNA-derived capture probes with high sequence similarity. We noticed that the patterns of specific spots for each strain were somewhat different in the two-dimensional gradation plot. Therefore, to discriminate subtle differences between phylogenetically related pathogens, a pattern-mapping statistical model was established using an artificial neural network algorithm trained by experimental repeats. The oligonucleotide microarray system harboring doubly specific capture probes combined with the pattern-mapping analysis tool resulted in successful detection of all target pathogens including even subtypes of two closely related species showing strong nonspecific binding. Collectively, the results indicate that our novel combined system of a 16S rDNA-based DNA microarray and a pattern-mapping statistical analysis tool is a simple and effective method for detecting multiple pathogens. Quantitative data analysis is an important element in several applications of DNA microarray, including mRNA expression profiling and estimation of infectious doses for pathogens. Here, we introduce an artificial standard probe strategy for quantitative pathogen detection using an oligonucleotide chip as a model system. The standard capture probe sequence was artificially designed to prevent non-specific hybridization with bacterial targets. Based on the fluorescence intensities of artificial standard spots, the raw fluorescence intensity data for specific spots could be corrected to generate linear correlations with target concentrations. Therefore, our novel artificial standard probe may be effectively applied for the correction of chip-to-chip variations and quantitative data analysis of a one-color labeled DNA microarray system. Finally, for practical use of the constructed 16S rDNA microarray, we employed direct detection strategy based on 16S rRNA. Without further reaction or purification, asymmetrically amplified DNA, purified total RNA, or cell-lysed total RNA targets were applied to direct co-hybridization with specific capture and fluorescence dye-labeled detector probes. Especially, using cell-lysed RNA targets, all species were clearly detected with perfect match-based analysis and showed better specificity than experiments using PCR labeled 16S rDNA target. Sensitivity of direct detection was 102 ？ 103 times higher than that of other reports. In addition, we applied direct detection method to food sample and obtained similar level of fluorescence intensity and sensitivity in pure pathogen case without food sample. Collectively, the present results indicate that our novel 16S rDNA-based oligonucleotide chip detection system can be successfully utilized for the effective detection of multiple pathogens, and expanded with a rapid and easy ？add-up？ concept for many other microorganisms in food or a clinical environment.