Drop-on-demand Inkjet-based Bioprinting

Abstract

A burgeoning bioprinting facilitates fabrication of complex biological architecture, and has reinvigorated the endeavors to fabricate artificial biological organs. Specifically, a drop-on-demand (DOD) inkjet printing technology has proved great potential in bioprinting through tremendous progress. However, the whole process of DOD inkjet-based bioprinting has not been fully understood, and in particular the employment of small nozzle is crucial for high resolution of printing mammalian cells with average diameter ranging from 15–20 µm. The aim of this thesis was to explore the whole historical trajectory of cell from loading into nozzle tip to impacting and sinking through ≥30-µm nozzle. To pursue this aim, the key research questions are brought to section 1.2. Chapter II provides the overall background and literature reviews associated with this works, and chapter III outlines the materials characterization and experimental methods. Chapter IV presents a hydrodynamics on cell movement in nozzle, a relationship between cell and jet morphology, and optimized condition for stable single drop formation. Chapter V includes relationship with cell type (NIH/3T3 and HEK293A), cell concentration, and nozzle diameter (30, 50, and 80 µm) to number of cells per drop. In a connection with the relationship, high portion of printing single-cell laden droplet was demonstrated. Moreover, behaviors of impacting and sinking are analyzed, and abundant evidences on no cytotoxic effect are suggested by three assays. Chapter IV presents an in-depth study for dynamics on meniscus pinned at inkjet nozzle tip. Finally, chapter VII summarizes the works presented throughout all chapters, addresses the research questions, and provides two further works including integration with microfluidic system.

본 박사학위 논문에서는 요구적출형(drop-on-demand) 잉크젯 기반의 바이오프린팅 전체 과정을 세포 거동 관점으로 소개한다. 바이오프린팅의 궁극적 목표는 생체 조직과 기관을 제작하는 것으로, 이를 위해서는 단일 세포 수준의 정교한 패턴 제작과 더불어 세포에 작용하는 동역학을 기반으로 한 거동 제어가 필수적이다. 이러한 필요성을 충족하기 위해 포유류 세포 크기에 상응하는 직경이 30 µm 인 노즐을 도입함으로써, 단일 세포 수준의 고정밀성을 보였으며, 바이오프린팅 전 과정에 있어서 세포의 동역학을 분석함으로써 세포 제어에 필요한 제반 기술을 제공하였다. 또한 잉크젯 기반의 높은 단일 세포 토출 결과도 구현하여 약물평가 등의 활용 가능성을 보였다. 제 2장에서는 바이오 프린팅과 요구적출형 잉크젯 기반의 세포 프린팅에 대한 전반적인 배경지식 및 발전방향을 소개한다. 먼저 인공 장기 제작을 위한 바이오프린팅의 역사적 필요성과 당면 과제를 조사하였고, 바이오프린팅에 활용되고 있는 대표적인 기술들의 장단점을 비교하였다. 이 기술들 가운데, 소량의 액적을 목적한 위치에 고정밀도로 제어할 수 있는, 요구적출형 잉크젯 기술을 상세하게 살펴보았다. 특히 세포 프린팅 관련 선행연구들을 분석하여, 적용된 노즐 직경 등의 성과를 표 2.1에 정리하였다. 또한 잉크젯 프린팅 성능 향상에 요구되는 계면 안정성을 위해, 계면 거동에 관련된 Faraday 불안정성과 서브하모닉스(subharmonics)를 설명하였다. 제 3장에서는 실험에 사용된 물질들과 방법들을 소개한다. 먼저, 세포 프린팅에 사용된 2종류의 세포들, NIH/3T3 와 HEK293A 의 배양법과 세포 크기 측정, 생존율 및 증식율 분석 방법을 설명하였다. 다음으로 바이오잉크의 제조와 특성을 설명하였다. 전단응력에 따른 점도 측정과 세포의 체적분율(volume fraction) 계산을 통해 세포 담지 바이오잉크(cell-laden bioink)를 뉴턴유체로 가정할 수 있었고, 점도와 더불어 동적 표면장력 측정을 통해 프린팅 적합성(printability)을 가늠하였다. 또한, 노즐 내 세포 이동과 액적 형성 과정, 충돌(impacting) 과정 등의 관찰을 위해서 2가지 고속 촬영기법인, 초고속카메라를 이용한 시네마토그래피(cinematography)와 섬광을 이용한 섬광 촬영기법(flash-photography)를 도입하였고, 맞춤형 프린팅 시스템을 구축하였다. 끝으로, 잉크젯 노즐에서의 계면 거동을 모사하고자, 양끝단이 고정된 평행판 사이의 1차원 계면 모델로 단순화하고 레이저 시트(laser sheet) 가시화 기법과 FFT(fast Fourier transform) 분석을 적용하였다. 제 4장에서는 노즐 내 세포의 이동과 세포로 인한 액적의 형상 변화, 세포 함유 액적의 안정적 형성을 소개한다. 먼저 노즐 내 세포의 거동 관찰로부터 노즐 내 포물선 형태의 유동장과 세포의 ‘고 앤 스탑’(go-and-stop) 움직임을 확인하였고, 토출되는 액적의 체적과 세포에 작용하는 외력을 분석하여 침적속도(settling velocity) 등 세포의 거동을 모사하였다. 다음으로 세포가 없는 바이오잉크의 경우 안정적이고 규칙적인 액적이 생성되는 반면, 노즐을 통과한 세포가 함유된 경우 노즐의 직경에 따른 액적의 형상 변화에 차이가 있었다. 직경이 80 µm 인 노즐에서 생성된 세포 담지 액적의 경우, 리가먼트(ligament)가 세포보다 굵기 때문에 형상의 변화가 미비하였고, 세포 집합체(aggregate)도 막힘없이 토출되었다. 대조적으로, 직경이 30 µm 인 노즐에서 생성된 액적의 경우, 리가먼트가 세포보다 가늘기 때문에 형상 변화의 정도가 컸다. 하지만 세포가 세포보다 크기가 큰 헤드에 있는 경우 형상 변화가 미비한 것을 발견하였고, 이로부터 단일 액적 형성 조건을 최적화함으로써 1e5 개 이상의 안정적인 액적 형성을 보였다. 제 5장에서는 토출된 세포 함유 액적의 유리 기판과 액체 수조로의 충돌을 소개한다. 먼저 유리 기판에 충돌된 액적 배열(array)을 통해, 3가지 변수(세포 종류, 세포 농도, 노즐 직경 크기)에 따른 액적 내 세포의 개수를 분석하였다. 액적 내 세포의 개수는 Poisson 분포를 따르는데, 세포 종류에는 무관하고, 세포 농도와 액적 체적에는 선형 비례하는 관계를 보였다. 이로부터 변수 제어를 통해 액적 내 세포 개수의 조절 가능성을 확인했다. 가령, 직경이 30 µm 인 노즐에서 5.0 × 1e6 cells•mL-1 농도의 바이오잉크를 프린팅했을 때 액적 내 평균 세포 개수는 1.3개였으며 35% 이상의 단일 세포 토출 결과를 얻었다. 다음으로, 액체 수조로의 충돌을 통해 세포 함유 액적의 형상과 액체 내 세포의 강하(sinking) 거동을 분석하였다. 액적은 액체 수조와 충돌시 버섯모양의 구름 형상을 갖으며, 충돌 후 세포는 해당 충돌 속도 조건에서 액적 내 세포 위치에 따라 167 ± 32 µm 의 초기 침투 깊이까지 감속하고 이후로는 Stokes 저항과 균형을 이루어 등속으로 강하하는 거동을 보였다. 이로부터 세포가 액체 수조의 바닥에 강하게 충돌하는 것을 방지하기 위한, 수조의 최소 높이에 대한 기준을 마련하였다. 끝으로 프린팅 직후 생존율과 7일간의 증식율, 5일차 세포의 DNA 와 형상 비교를 통해서, 직경이 30 µm 인 노즐을 사용해도 세포에 악영향이 없음을 보였다. 제 6장에서는 잉크젯 노즐의 계면 거동에 대한 심층 연구로, 양끝단이 고정된 평행판에서 상하 기계진동으로 발생한 표면장력파를 소개한다. 인가 주파수(applied frequency)에 따른 1차원 정상파의 모드(mode)와 인가 가속도에 따른 서브하모닉과 하모닉(harmonics)의 발생 경계를 실험적으로 분류하였다. 그리고 Faraday 불안정성 맵을 통해, 구조적 차이로 인한 실험적 발생 조건과 Mathieu 방정식의 해(solution)의 차이를 정리하였다. 또한 임계가속도(onset acceleration) 이상에서 서브하모닉이 발생할 때, 횡방향과 종방향의 2차원 패턴이 발생하는 것을 관찰하였다. 하지만 모드 3 이상의 고주파수 영역에서는 인가 가속도가 임계가속도에 도달하기 전에 계면이 깨져서 서브하모닉 운동은 관찰할 수 없었다. 본 학위 논문에서는 직경이 30 µm 인 잉크젯 노즐을 도입하여, 단일 세포 크기의 고해상도를 갖는 요구적출형(drop-on-demand) 잉크젯 기반의 바이오프린팅 전체 과정을 살펴보았다. 특히 세포 거동 분석을 중점으로 하여 장기 안정적 액적 형성과 단일 세포 토출, 액체 수조의 최소 높이 기준, 세포 안정성 등의 결과를 보였다. 이 결과를 통해, 바이오프린팅의 궁극적 목표인 단일 세포 수준의 정교한 생체 구조물의 제작을 기대한다. 또한 제 7장에 기술한 후속연구처럼, 미세유체역학(microfluidics) 시스템과의 통합과 알지네이트 비드(alginate bead)의 형상 규명 등에 활용될 것이다.