DNA 중합효소의 교정과정과 MutL-ssDNA 결합에 대한 단일분자 연구

Abstract

개별 생체분자의 움직임을 실시간으로 관측할 수 있는 단분자 생물리(single-molecule biophysics) 기술의 발전을 통해 본질적으로 불균질한(heterogeneous) 세포 및 단백질의 움직임을 실시간으로 관측할 수 있게 되었다. 우리는 그 중에서 flow-stretching과 단분자 Forster Resonance Energy Transfer (FRET) 기술을 응용해 대장균(Escherichia coli)의 염기쌍 오류복구(mismatch repair) 및 DNA 복제(replication) 과정에 관여하는 단백질의 움직임을 관찰하였다. DNA 복제 과정에서 발생하는 염기쌍 오류를 고치는 일은 DNA에 기록되어 있는 유전정보를 온전하게 보존하기 위해 매우 중요하므로, 적어도 두 가지 과정을 통해 문제가 있는 염기쌍을 복구하게 된다. DNA 합성과 동시에 일어나는 교정(proofreading)을 통해 일차적으로 복구하고, 여기서도 고쳐지지 않은 오류는 염기쌍 오류복구 과정을 통해 다시 한 번 검사받게 된다.

DNA 중합효소 III(DNA Polymerase III)는 β 클램프와 결합하여 매우 빠르게 DNA 합성을 진행할 뿐만 아니라, 그 과정에서 발생하는 염기쌍 오류를 자체적으로 제거하고 복구해 최대 1000배 정도 DNA의 정확도를 향상시키는 기능도 가지고 있다. β와 결합을 한다고 알려진 α와 ɛ은 각각 뉴클레오타이드(nucleotide)를 합성하거나(5' → 3'), 오류가 발생했을 시 제거하는(3' → 5') 중합효소의 소단위(subunit)이다. 따라서 중합효소가 일할 때 합성모드와 교정모드라는 (적어도) 두 가지 모드가 존재하게 된다. 합성과정에 대해서는 매우 많은 연구가 진행되어 있지만, 교정모드에서 일어나는 핵산분해활동(exonucleolytic activity)에 대해서는 자세한 동역학적 사실이 알려져 있지 않다. 우리는 교정모드에서 핵산분해활동의 전체적인 속도(∼2 nt/s)와 프로세시비티(processivity, ∼600 nt)를 측정하였고, 과정 사이사이에 일어나는 짧은 멈춤(∼4 s)도 관찰할 수 있었다. β와 ɛ 사이의 상호작용 세기를 변화시키는 ɛ 돌연변이를 이용해서 β-ɛ 결합이 핵산분해활동이 일어나는 데 필요하다는 사실도 밝혀내었다. 이는 기존 모델과는 다르게, 교정모드가 작동하고 있을 때 α-β-ɛ가 서로 결합하여 닫힌 형태로 작동한다는 사실을 암시한다.

MutL은 염기쌍 오류복구 과정 전반에 관여하는 중심적인 단백질로, 홑가닥(single-stranded) DNA와 결합하는지, 만약 그렇다면 그 역할은 무엇인지에 대한 논란이 있다. 우리는 단분자 FRET과 flow-stretching을 이용하여 MutL이 홑가닥 DNA의 길이를 늘이면서 결합하고 또 떨어지는 과정을 실시간으로 관찰할 수 있었다. 하지만 이런 현상은 낮은 염농도에서만 관찰되었고(25 mM NaCl에서 K_D = 29 nM), 100 mM 이상의 염농도에서는 거의 발견되지 않았다(K_D > 2 µM). 따라서 MutL과 홑가닥 DNA 간의 상호작용은 생리적인 조건에서 일어나는 현상이라 보기 어려우며, MutL이 홑가닥 DNA에 홀로 붙어 염기쌍 오류복구를 진행하는 모델의 가능성을 낮춘다.

During DNA replication, DNA polymerases can generate mismatched base pairs (bp) with the error rate of 10^(−4)/bp. However, the proofreading ability of DNA polymerases reduces the error rate up to 10^(−7)/bp by its exonuclease activity. Even the low error rate in human cells may lead to about 3,000 errors per cell division, which ultimately have catastrophic consequences for genome integrity. DNA mismatch repair (MMR), a system for recognizing and removing the mismatch, ensures the genomic stability on DNA replication, which increases the overall fidelity of DNA replication up to 1,000 fold (the error rate ∼10^(−10)/bp).

Single-molecule studies has enabled access to heterogeneous aspects of biological events by removing ensemble averaging, which allows us to elucidate the salient features of the molecular and cellular mechanism in a variety of biological processes. In this thesis, the proofreading of E. coli DNA polymerase III and the interaction of E. coli MutL with single-stranded DNA (ssDNA) during MMR were studied at the single-molecule level.

The DNA Polymerase III (Pol III) core consists of α, ɛ and θ subunits, processively synthesizes DNA in complex with β2 clamp, and also removes misincorporated nucleotides to correct the error of base pairs. The α subunit is a catalytic core of DNA synthesis in the 5' to 3' direction, but the subunit catalyzes the 3' to 5' exonuclease activity. In the polymerase mode, both α and ɛ subunits directly contact β2. In contrast, in the exonuclease mode the interaction of ɛ with β2 is unknown. Moreover, the dynamic features of the proofreading of Pol III have not yet characterized well. The overall excision rate (2 nt/s) and the processivity (600 nt) of the Pol III core associated with β2 were determined by using the flow-stretching assay. Stronger interaction between ɛ and β2 enhances the proofreading activity of Poll III, which was shown through the kinetic parameters of ɛ-subunit mutants that affect its interaction with β2-clamp. The results suggest that the physical interaction of the ɛ subunit in the Pol III core with β2-clamp is required for the proofreading mode as well as the polymerase mode.

DNA binding by MutL during MMR has been considered based on biochemical and genetic studies. Conventional ensemble studies with MutL and its yeast homologs Mlh1-Pms1 have suggested an integral role for ssDNA binding activity during MMR. Single-molecule techniques were employed to examine E. coli MutL interaction with ssDNA in real time. The single-molecule Forster resonance energy transfer (smFRET) has revealed that MutL-ssDNA binding was the greatest at ionic strength below 25 mM (K_D = 29 nM) in the presence of ATP while it dramatically decreases above 100 mM (K_D > 2 µM). Single-molecule DNA flow-stretching analysis shows that multiple MutL proteins bind ssDNA at low ionic strength but this activity does not increase stability at elevated ionic strengths. These studies suggest that a stable MutL-ssDNA interaction is unlikely to occur during MMR.