인간 세포의 DNA 오류 염기쌍 제거 단일분자 역학 연구

Abstract

단 분자 생물물리 (single-molecule biophysics) 분야의 발전으로 기존의 생물학적 방법들로 볼 수 없었던 개별 생체분자의 움직임을 실시간으로 관찰할 수 있게 되었고, 이를 통해서 생명체의 본질적인 비균질적인 특성도 확인하게 되었다. 이러한 비균질성을 관찰하고 이해함으로써 생명체의 근원에 대해서 좀 더 가까이 다가갈 수 있었다. 학계에서는 그 동안 밝히지 못했던 많은 생물학적 질문들을 단 분자 생물물리 기술을 통해서 풀어나가고 있다. 이 학위논문에서는 Flow-stretching, Förster resonance energy transfer (FRET) 그리고 Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) 등의 단 분자 기술들을 응용하여 인간의 DNA 오류 염기쌍 복구과정 중 DNA가닥 제거 메커니즘을 연구하였다. 유정정보를 담고 있는 DNA를 복제하는 과정 동안에는 적지만 치명적인 오류 염기쌍을 만들 수 있다 (10-7/bp). 이를 고치는 일은 DNA에 기록되어 전달되는 유전정보를 온전하게 보전하기 위해서 매우 중요한 일이다. DNA 오류 복구 과정을 통해서 DNA 복제 에러를 약 10-10/bp까지 줄일 수 있다. 이 과정은 진화적으로 크게 보존되어온 MutS homologs (MSH) 단백질과 MutL homologs (MLH/PMS) 단백질에 의해서 활성화 된다. MSH 단백질은 맨 처음 오류 염기쌍을 인식하는 역할을 하고, 매우 안정적인 슬라이딩 클램프를 형성하여 MLH/PMS 단백질과의 상호작용을 통해서 오류 염기쌍을 포함한 DNA 가닥 제거를 전체적으로 지휘하는 역할을 한다. 오류 염기쌍을 포함한 DNA 가닥을 제거 할 때 그 시작되는 위치에 따라서 3’-방향과 5’-방향 복구 과정으로 나눌 수 있는데, 우리는 5’-방향성 복구 과정에 집중하였다. 정제된 단백질로 인간세포의 5’ 방향성 DNA 오류 염기쌍 복구 과정을 재현할 때에는 오류 염기쌍을 인식하는 HsMSH2-HsMSH6 단백질, 5’  3’ 방향성의 핵산분해능력을 가진 Exonuclease I (HsEXOI) 그리고 진핵세포에서의 DNA 단일가닥 결합 단백질인 Replication Protein A (HsRPA) 단백질을 필요로 한다. 또한 HsMLH1-HsPMS2 라는 단백질도 관여하는데, 상대적으로 3’-방향 복구과정에서의 역할은 알려 있지만 5’-방향 복구과정에서의 역할은 아직 불투명하다. HsMLH1-HsPMS2는 세포 추출물 (Cell extracts)에서는 5’-방향 복구과정에 영향을 주지만 정제된 시스템 (purified human 5’-MMR) 에는 요구되지 않는다고 알려져 있다. 우리는 단 분자 이미징 기술을 사용하여 HsEXOI 단일 단백질에 의한 핵산분해활동의 속도 (~4 nt/s) 와 진행도 (processivity, ~1300 nt) 를 측정하였다. 또한 HsEXOI 단백질의 핵산분해활동이 HsRPA나 EcSSB 같은 DNA 단일가닥 결합 단백질에 의해 크게 억제되지만, HsMSH2-HsMSH6 단백질이 이를 극복하여 다시 HsEXOI의 핵산분해활동을 활성화 시키는 것을 관찰하였다. 오류 염기쌍에서 다수의 슬라이딩 클램프를 형성할 수 있는 HsMSH2-HsMSH6의 성질은 HsEXOI에 의해서 제거되는 DNA 가닥의 양을 늘이는 역할을 한다. 하지만 역으로 HsMLH1-HsPMS2는 HsMSH2-HsMSH6의 수를 조절 함으로써 제거되는 DNA 가닥의 길을 제어하는 역할을 하는 것을 관찰하였다. 이를 통해서 HsMSH2-HsMSH6와 HsMLH1-HsPMS2, 그리고 HsRPA가 상호보완적으로 HsEXOI의 핵산분해 활동을 조절함으로써 효과적인 5’ 방향의 오류 염기쌍 복구 과정을 수행하는 모델을 제시하였다.

Development of the single-molecule biophysics field has enabled us to observe the dynamics of individual molecules that is not allowed by typical ensemble methods and also has identified the intrinsic heterogeneity of biological systems. Through the observation and understanding of the heterogeneity, we could get close to the fundamental features of life. A variety of unsolved questions have been unravelled by aid of single-molecule approaches. In this thesis, using novel single-molecule techniques of flow-stretching and fluorescence imaging including Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and Protein Induced Fluorescence Enhancement (PIFE), the mechanism of strand excision during Human DNA mismatch repair (MMR) has been studied. DNA polymerases generate duplication errors that result in nucleotides mismatch during DNA replication (error rate: 10-7/bp). It is critical to repair the mismatch for preserving the genomic integrity engraved in DNA. There is a highly conserved MMR system that decreases the replication error rate up to 10-10/bp per generation in cells. MMR is activated by evolutionarily conserved MutS homologs (MSH) and MutL homologs (MLH/PMS). The MSH recognizes mismatched nucleotides and forms extremely stable sliding clamps that may be bound by the MLH/PMS to ultimately authorize strand-specific excision starting at a distant 3’- or 5’-DNA scission. Here, we focused on the 5’-MMR process. The purified human (Homo sapien or Hs) 5’-MMR excision reaction requires the HsMSH2-HsMSH6 heterodimer, the 5’3’ exonuclease: human exonuclease I (HsEXOI), and the eukaryotic single-stranded DNA binding protein: replication protein A (HsRPA). The HsMLH1-HsPMS2 heterodimer substantially influences 5’-MMR excision in cell extracts but is not required in the purified system. Thus, the role of HsMLH1-HsPMS2 in the 5’-MMR has been ambiguous. Based on the real-time single-molecule imaging, the hydrolytic activity of single HsEXOI molecule that includes the rate (~4 nt/s) and processivity (~1300 nt) were firstly measured. HsRPA or Escherichia coli EcSSB effectively restricts HsEXOI excision activity on nicked or gapped DNA by binding to a ssDNA proximal to the HsEXOI. The HsMSH2-HsMSH6 activated HsEXOI by overcoming HsRPA/EcSSB inhibition and exploited multiple dynamic sliding clamps to increase the excised track length by HsEXOI. Conversely, HsMLH1-HsPMS2 regulates the excised track length by controlling the number of excision complexes, providing a link to 5’-MMR. These observations are proposed to the mechanism that multiple MMR proteins including HsMSH2-HsMSH6, HsRPA and HsMLH1-HsPMS2 cooperate with each other to regulate the excision reaction of HsEXOI for efficient MMR processes.