Discovery of new therapeutic agents using extracellular vesicles based sepsis drug screening system

Abstract

Sepsis is a systemic inflammatory response syndrome triggered by an infection, with the symptoms such as hypothermia, tachypnea and leukopenia. Secretion of pro-inflammatory cytokines like TNF-α is induced in septic environment, and especially, TNF-α, a master regulator, excessively activates the host immune system by triggering inflammatory cascades. This massive activation provokes the successive intravascular coagulopathy and multiple organ failure eventually. Due to this severe consequence of sepsis, its mortality rate reaches up to 30%, which increases the social cost of treatment. Though antibiotics treatment is usually used to treat sepsis, it can even exacerbate the status of disease by the activation of host immune system with increased amount of released bacterial cell wall components. Because there is no commercial and specific drug for sepsis, new therapeutic agents are urgently required. To discover new therapeutic agents, I used the extracellular vesicles (EVs)-based in vitro screening system. The EVs derived from Escherichia coli were treated to Raw264.7 to induce the secretion of TNF-α. The 80 different kinds of kinase inhibitors were screened the ability to reduce TNF-α secretion in the system. From the screening, Damnacanthal was selected for the potent drug candidate, which is previously known as an inhibitor of p56 Lck. Moreover, Damnacathal showed the inhibitory effects on TNF-α secretion induced by various single PAMPs in vitro and on the infiltration of immune cells in skin inflammation model induced by EVs in vivo. To verify the mechanism of anti-inflammatory function of Damnacanthal, the inhibitory effects on TNF-α secretion was verified in Src family kinase inhibitors such as PP1, PP2 and PP3 (negative control for PP2); PP1 and PP2 also reduced the TNF-α secretion induced by EVs. Then, the kinase inhibitor activities of Damnacanthal, PP1 and PP2 were assessed to confirm the relationship between the suppression of TNF-α secretion and the inhibition of Src family kinase. As a result, PP1 and PP2 inhibited the phosphorylation (Tyr416) of Src family kinase, but Damnacanthal did not inhibit the phosphorylation despite the existence of Hck, Lck and c-Src in Raw264.7 cell. These indicated that the anti-inflammatory effects of Damnacanthal are not dependent on the inhibition of Src family kinase activity. As an alternative, I focused on the anti-inflammatory cytokines, especially interleukin-10, which is known to suppress the production and release of TNF-α. Since Damnacanthal induced the secretion of interleukin-10 in the EV-based screening system, the inhibitory effects on TNF-α secretion by Damnacanthal seem to be mediated by interleukin-10. Therefore, the inhibitory ability of Damnacanthal for TNF-α secretion, which reduces the damages on cells or tissues, can be used to treat sepsis.

패혈증 (sepsis)는 감염에 의해 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 질병이다. 저체온증, 빈호흡, 백혈구 감소 등의 증상을 동반하며, TNF-α 와 같은 염증성 사이토카인 분비를 촉진 시켜 면역 체계를 과도하게 활성화하고, 이는 혈관 내 혈액 응고 장애를 야기시켜, 마침내 복합 장기 부전을 유발시킨다. 이러한 패혈증 환자의 사망률은 30%에 이르고, 이로 인한 사회적 비용 역시 크게 증가하고 있다. 이를 치료하기 위해 흔히 사용되는 항생제 치료의 경우 오히려 세균의 구성 성분들을 혈액 내로 퍼지게 하여 패혈증을 더욱 악화시킬 수 있으며, 이 밖에 다른 치료제의 개발이 시급한 상황이다. 이러한 패혈증의 새로운 약물을 발굴하기 위해 Raw264.7 세포에 세균 유래 Extracellular vesicle을 처리하여 TNF-α 분비를 유도하는 screening system을 이용하였다. Extracellular vesicles-based screening system에서 80 종의 Kinase inhibitor가 EV로 유도된 TNF-α 분비를 저해하는 정도를 확인하였고, 그 결과 p56 Lck의 기능을 저해한다고 알려진 Damnacanthal이 치료 약물 후보로 선정되었다. Damnacanthal의 항 염증 효과를 확인하는 실험에서 Damnacanthal은 다양한 single PAMP로 인해 유도된 TNF-α 분비를 억제하였고, EV로 피부에 유도된 염증에서 패혈증의 증상 중 하나인 면역 세포의 조직 내 침입을 저해하는 효과를 보였다. Damnacanthal이 대식세포에서 TNF-α 분비를 저해하는 항 염증 작용의 기전을 알아보고자 Damnacanthal과 같이 Src family kinase를 저해하는 PP1, PP2와 PP2의 대조군으로 사용되는 PP3에 대해 TNF-α 분비 저해 능력을 살펴 본 결과, PP1과 PP2 역시 TNF-α 분비를 저해하였다. Src family kinase 억제가 TNF-α 분비 저해 능력과 관계가 있는지 확인하기 위해 Damnacanthal, PP1, PP2가 Src family kinase 활성화를 억제하는 지 여부를 확인하였다. Hck, Lck, c-Src과 같은 Src family kinase 가 Raw264.7 세포에 존재하는 것을 확인하였으나, Damnacanthal의 경우 Src family kinase의 인산화 (활성화)를 저해하지 못해, Damnacanthal의 TNF-α 분비 저해 능력은 Src family kinase 비활성화에 의존적이지 않다는 결론을 내릴 수 있었다. TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 생성과 분비를 억제한다고 알려진 항 염증성 사이토카인 IL-10에 주목하여, EV-based screening system에서 Damnacanthal이 IL-10 생성을 유도하는지 여부를 확인한 결과, Damnacanthal은 대식세포에서 IL-10 생성 및 분비를 촉진하는 것으로 확인되었다. 이로써 Damnacanthal의 TNF-α 분비 저해 능력은 IL-10을 통한 항 염증성 반응에 의해 매개되는 것으로 보이며, TNF-α 분비를 저해하여 면역 체계가 과도하게 활성화되는 것을 막는 Damnacanthal은 패혈증의 치료 약물로 사용될 수 있을 것으로 보인다.