Regulatory mechanism of EGF-induced EGFR phosphorylation patterns at the single-molecule level

Abstract

세포막에 존재하는 수용체티로신인산화효소 (Receptor Tyrosine Kinases, RTKs)는 번역 후 변형(Post-Translational Modifications, PTMs)을 통하여 외부로부터의 다양한 자극을 수렴하고 세포 내 신호전달을 조율한다. RTKs를 포함한 대부분의 신호전달 단백질들은 단백질 분해 효소(Proteases)와 인산화효소(Kinases), 메틸화효소(Methylases)와 같은 전이 효소와 탈인산화효소(Phosphatase)와 같은 분해 효소에 의해서 여러 아미노산 잔기가 변형된다. 이러한 각각의 PTM과 특정 세포의 기능의 연관성은 오랜 시간 동안 잘 연구가 되어 있다. 하지만, 대부분의 단백질들은 여러 개의 PTM들이 다중 다발적으로 일어나고, 단일 단백질 분자에 PTMs의 조합(Combinatorial PTMs)에 따라 서로 다른 성격을 가지며 별개의 역활을 수행한다고 추정되지만 아직 구체적으로 알려진 바가 없다.

PTM을 발굴하는 Western Blot과 질량분석기를 활용한 단백질 분석과 같은 현재의 일반적인 방법들은 단일 단백질 분자의 Combinatorial PTMs을 간과하게 하는 Ensemble 결과를 제공한다. 따라서, 단분자 수준에서 한개의 단백질 분자에 서로 다른 아미노산 잔기가 동시에 변형이 되는지 아닌지를 연구하기 위하여, 본 연구에서는 처음으로 Biotin을 세포막 표면 단백질에 표지하는 기술과 전반사 현미경을 이용한 단분자 형광 이미징 기술을 결합하여 Single-Molecule Blotting (SiMBlot)이라는 기술을 개발하였다. SiMBlot 분석은 세포막에 존재하여, 세포 내 신호전달을 조율하는 리간드 결합에 의한 RTKs 의 인산화를 형광 단백질 표지된 RTK 단분자와 PTM에 관한 면역 형광법(Immunofluorescence)을 통하여 형광 분자의 수를 측정함과 동시에, Colocalization을 분석함으로서 정확하게 정량화 할 수 있다. 또한, SiMBlot 분석은 표적 단백질 고정에 Biotin-NeutrAvidin 결합을 이용함으로서, 항체 없이 RTK 분자들을 Single-Molecule Surface에 고정시킬 수 있음으로, 고정시키기 위한 항체의 Host Species에 의한 제한을 받지 않는다. 이러한 특성은 면역 형광법에 사용하는 항체를 좀 더 자유롭게 선택할 수 있을 뿐만 아니라, 다중 면역 형광법(multiple immunofluorescence)을 가능하게 한다. 또한, 여러가지 Site-specific 항체를 이용한 다중 면역 형광법을 활용하여, SiMBlot 분석에서는 서로 다른 형광의 Colocalization을 분석함으로써 각각의 RTK 분자들의 Pairwise site-specific modifications을 직접적으로 시각화할 수 있다. 본 연구에서는 처음으로 단분자 수준에서 세포막 수용체의 PTM의 상태를 직접적으로 가시화하는 단분자 영상기술을 개발하였다.

대표적인 RTK 단백질로서, 다양한 세포의 기능을 조절한다고 알려진, 표피성장인자수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)은 EGF 자극에 의해서 다중 인산화가 생긴다고 오랜시간동안 널리 알려져 왔지만, 아직 실험적으로 확인된 바가 없다. 따라서, 본 연구에서는 SiMBlot 분석을 적용하여, EGF 에 의한 EGFR의 여러가지 조합(자기인산화 셋: pTyr845- pTyr1173, pTyr1068-pTyr1173; 피드백 셋: pThr669-pTyr845, pThr669- pTyr1068)의 Pairwise site-specific phosphorylation 패턴을 분석하였다. 기존에 통념적으로 알려진 것과 달리, 세포막에서 EGF 에 의한 EGFR의 인산화는 대부분 단일 인산화이고, 다중 인산화는 거의 일어나지 않았다. 반면에, in vitro에서 자기인산화를 했던 EGFR 에서는 거의 50%가 다중 인산화가 되었음을 볼 수 있었다. 이러한 결과는 기존에 PTM연구에 일반적으로 사용하는 Western Blot과 같은 방법으로는 알 수 없는 정보였지만, SiMBlot을 통해서 처음으로 알아낼 수 있었다. 또한 Co-occurrence test를 통하여 in vitro 자기인산화 EGFR에서의 다중 인산화는 각각의 인산화가 연관된 것이 아니라 Kinases의 지속적인 활동에 의해 누적된 결과임을 밝혀내었다. 따라서, SiMBlot의 Colocalization 분석은 기존의 생화학적 분석법들의 한계로 의해서 간과해왔던 EGFR의 PTM 조절 기전에 관한 실마리를 처음으로 제공한다.

그리고, 세포막에서 EGF 자극에 의하여, EGFR이 거의 대부분 단일 인산화가 되는 이유를 밝히기 위하여 EGFR의 인산화 조절과 연관된 다양한 조절기전을 검증하였다. 기존의 연구에 따르면, 세포막에서의 EGFR의 Tyrosine 인산화의 반감기가 수초 수준으로 매우 짧고, 그래서 EGF 초기자극에서 매우 빠르게 탈인산화(De-phosphorylation)된다고 한다. 따라서, 세포막에서 EGFR의 단일 인산화의 원인이 빠른 탈인산화에 의해서 인산화의 누적이 일어나지 않기 때문인지를 확인하기 위하여 강력한 Tyrosine Phosphatase Inhibitor인 Pervanadate 를 처리해 보았다. 세포 내 Phosphatase를 강제로 억제하였을때, EGF 자극에 의한 EGFR의 인산화가 급격히 증가함과 동시에 다중 인산화 EGFR이 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, 세포막에서 EGFR의 단일 인산화는 세포 내에서의 인산화와 탈인산화의 균형에 의한 결과임을 밝혔다.

본 연구를 통해서, 기존 연구 방법의 맹점으로 인하여, 숨어있던 Combinatorial PTMs를 연구할 수 있는 기반 기술인 SiMBlot 분석법을 개발하였다. 또한, 비록 대표적인 세포막 표면 수용체인 EGFR에만 적용시켜 보았으나, 오랜시간동안 맹목적으로 믿어왔던 EGFR 인산화 과정을 검증했을 뿐만 아니라 새로운 조절 기전의 가능성을 제시하였다. 그리고 SiMBlot 분석은 화학적, 효소적인 방법을 이용하여 특정 단백질에 Biotin을 표지하는 기술과 융합함으로서 Histone과 RNA Polymerase와 같은 다중 PTMs을 가진 다양한 신호전달 단백질의 PTMs 연구에 활용 될 것으로 기대된다.

Post-translational modifications (PTMs) of receptor tyrosine kinases (RTKs) at the plasma membrane (PM) integrate the multiple signaling from an environmental change and determine the signal transduction efficacy. Most of signaling proteins, including RTKs, have modified on multiple amino acid residues by diverse enzymes such as proteases, transferases (kinases, acetyltransferases, methyltransferases, etc.), or enzymes that remove groups (phosphatases, deacetylases, glycosidases, etc.). Studies of each PTM sites to one particular cellular response are well established. However, although many proteins are multiply modified, combinatorial PTMs on a single polypeptide molecule, which may lead to distinct biological response, have not been elucidated.

Current approaches to identify PTMs provide ensemble results, inherent overlooking combinatorial PTMs in a single polypeptide molecule. Accordingly, in order to investigate simultaneous modifications of different sites on a single protein sequence, I firstly designed a single-molecule blotting (SiMBlot) assay that combines biotinylation of cell surface proteins with single-molecule fluorescence imaging technique using total internal reflection fluorescence microscopy. The SiMBlot assay enabled the exquisite quantification of ligand-induced tyrosine phosphorylation of receptor tyrosine kinases (RTKs), which closely control signaling efficacy, spatially localized in the plasma membrane by counting the number of fluorescent molecules and analyzing the colocalization between RTK molecules and PTMs. Moreover, in the SiMBlot assay, antibody-free immobilization provides a more flexible choice because it is not constrained by the immobilization antibody species and allows the simultaneous detection of multiple immunofluorescence signals. These novel features enabled the direct visualization of pairwise site-specific modifications of individual RTK molecules by colocalization analysis with site-specific antibodies. In this study, I developed the single-molecule imaging technique to directly visualize the PTM status of plasma membrane receptor molecules in the single-molecule level for the first time.

Epidermal growth factor receptor (EGFR), a well-known RTK to regulate diverse cellular functions, is widely thought to be multi-phosphorylated in response to epidermal growth factor (EGF) treatment. Thus, I applied the SiMBlot assay to investigate the pairwise site-specific phosphorylation patterns of EGFR in response to EGF treatment; the autophosphorylation sets (pTyr845 and pTyr1068 or pTyr1173 of EGFR) and the feedback sets (pThr669 and pTyr845 or pTyr1068 of EGFR). Unexpectedly, I found that EGF-induced EGFR on the cell membrane was mostly mono-phosphorylated and was rarely multi-phosphorylated, although the level of each site-specific phosphorylation was individually increased. Furthermore, I also found that near 50 % of in vitro autophosphorylated EGFR was simultaneously multi-autophosphorylated, contrary to the similar results with cell model experiment in the western blot assay. By the co-occurrence test, I verified these pairwise site- specific autophosphorylation patterns of rEGFR came from the accumulation of individual in vitro autophosphorylations. Therefore, colocalization analysis on the SiMBlot assay revealed the important regulation of kinase specificity in EGFR phosphorylation patterns, such as mono-phosphorylation, which may have been overlooked by conventional biochemical methods, which have inherent limitations in analyzing combinatorial PTMs.

Moreover, to investigate the reason of scarce multi-phosphorylated EGFR on cell membrane, I confirmed the diverse regulatory mechanisms related with EGF- induced EGFR phosphorylations. According to the previous studies, phospho- tyrosine residues on EGFR have half-lives of a few seconds and therefore, rapidly turn over 100-1000 times in the immediately early response to EGF treatment. Accordingly, I showed that, in order to preserve the EGFR phosphorylations, the inhibition of de-phosphorylation by pervanadate treatment, potent pan-specific tyrosine phosphatase inhibitor, caused the accumulation of multi-phosphorylated EGFR on cell membrane. This finding suggests that the mono-phosphorylated EGFR is the product of the dynamic balance between kinase and phosphatase activities.

In conclusion, I developed a novel assay system for the study of pairwise site-specific PTM patterns of cell surface receptor molecules. Furthermore, I found that EGF-induced EGFR on cell membrane, which is popularly believed to be multi- phosphorylated, was hardly multi-phosphorylated, unlike in vitro autophosphorylated EGFR, and the phosphatase activity was critical for the accumulation of multi-phosphorylated EGFR. Combined with EGF-dependent EGFR clustering on the cell membrane, these findings can provide a new insight that each site-specific phosphorylated EGFR likely has individual roles to recruit specific molecules for downstream signaling and to participate in receptor clustering and complex formation for EGFR signaling.