단일분자 수준에서의 수용체 세포내이입의 클라스린 피막 홈의 전-분배에 대한 연구

Abstract

Receptor mediated signal transduction is the first mediator for cell to transduce the signals from outside changes to cellular language. Once receptor senses their ligands, it changes their status, such as conformational change, dimer, oligomerization and phosphorylation to propagate signal to downstream cascade. Because they are the starting point of signaling at the membrane, abnormal regulation of receptor activity or expression level can cause major alteration of whole cell level signal transduction and those are highly implicated with many diseases. It’s the reason that over 45% of modern small molecule drugs are targeting the receptor mediated signaling pathways.

Clathrin-mediated endocytosis (CME) is one of the major pathways for various receptors, such as enzyme-linked receptors, G protein-coupled receptors and ion channel-linked receptors, to be internalized into cytosol to downregulate the expression level of the receptors on a plasma membrane. Furthermore, CME plays a critical role for receptor signaling during the internalization via a clathrin-coated pit (CCP). It has long been puzzled how CCPs can fulfill such roles without competition among receptors co-existing in a plasma membrane while only a small number of CCPs are expressed and one CCP can accommodate tens of receptors at most. Previously, it has been revealed that a subset of CCPs for epidermal growth factor receptor (EGFR) exists when activated by EGF, possibly to avoid the non-specific competition among receptor downregulation and signaling. However, the mechanism by which the subset of CCPs for activated EGFR forms is barely understood, mainly due to the lack of a tool to detect the early stage of cargo selection where only a few single molecules are involved.

To address this problem, a colocalized image between receptors and CCPs without ligands should be analyzed to examine whether a subset of CCPs exist when they are born or this event is resulted by receptor signaling generated upon ligand stimulation. However, such a colocalized image provides no meaningful information because receptors are distributed all over the plasma membrane without clustering inside of a CCP. Recently, super-resolution microscopy has emerged with the resolution limit of up to 20 nm. Nevertheless, the density of receptors is typically too high to resolve the exact positions of the receptors for co-localization in a plasma membrane because the average distance between any arbitrary membrane proteins are less than 20 nm. Thus, the information of co-localization between non-clustered receptors and CCPs cannot be captured even by super-resolution microscopy.

Here, I developed a novel co-localization method that can analyse single molecule level protein interactions using single particle tracking with super resolution microscopy in a intact living cell. My method (diffusivity based molecular co-localization) overcomes fundamental problems of current co-localization techniques that inherently contain false positive due to crowded receptor expression on the membrane and only available after receptor clustering, by sorting the molecules to be co-localized based on the diffusional information.

Diffusivity based molecular co-localization combines diffusional information as a new dimension of co-localization with spatial information, based on the concept that the diffusivity of two molecules must be the same if the two molecules are localized at the same position. I performed simultaneous multi-colour super-resolution imaging in live cell and single particle tracking to get the diffusional information of the molecules to be co-localized for diffusion based molecular co-localization. Diffusivity based molecular co-localization determines subjective molecules as co-localized, when the diffusivity, and spatiotemporality of the molecules are identically satisfied. Co-localization resolution of my methods is 20nm which is enough for analysing interaction between receptor and CCP with respect to the size of the CCP. Those properties of my method make it possible to avoid problem of conventional co-localization methods, which is induced by inherent molecular crowdedness of the receptors on the cell membrane.

Here, using diffusivity based molecular co-localization, I revealed the fundamental mechanism of CCPs to control competition and cooperation between receptors for their internalization. I identified a subset of CCPs specifically allocated for EGFR in a resting state, which is utilized for EGFR endocytosis when EGFR is activated by EGF. PICALM, which is known as CLASP, was necessary factor for determination of pre-allocated subset of CCP for EGFR. I found that not only EGFR but also other receptors such as transferrin r receptor and ErbB2 receptor that were regulated by clathrin mediated endocytosis also form a pre-allocated subset of CCP. I further observed that this pre-allocated subset of EGFR partially shares with that of ErbB2, whereas those of EGFR and transferrin receptor are mutually exclusive. These results providing a critical insight into the role of the pre-allocated subset of CCPs, to control competition and cooperation for occupancy of CCP among receptors by limiting the capacity for one type of receptors at the early stage of cargo selection using specific adaptor molecule. Also sharing and segregation property of different types of receptors for pre-allocated subset of CCP can be a window for signal transduction sorting criteria at the starting point of the signalling.

세포막 수용체는 세포 외부의 자극이나 환경의 변화를 가장 먼저 감지하여 그에 대한 세포의 적절한 반응을 일으키기 위해서 그것을 세포의 언어로 변환시켜 세포 내부로 전달하는 기능을 수행한다. 세포막 수용체가 신호를 감지하면 주로 그 구조를 변경하거나 이합체나 다중 결합체를 형성하고, 인산화와 같은 변화를 거쳐 세포 내부로 신호를 전달하게 된다. 위와 같은 세포막 수용체의 세포 생존에 필수적인 감작 기능으로 말미암아 세포막 수용체의 비정상적인 활성이나 발현의 변화는 다양한 질병과 연관이 되어있다. 또한 세포막 수용체는 일련의 연관된 기능의 하부 신호 전달 체계를 형성하고 있기 때문에, 세포막 수용체를 인위적으로 적절히 조절하는 것은 일련의 복잡한 신호전달체계 자체를 단 하나의 대상 물질로 제어 할 수 있는 이점이 있다. 따라서 세포막 수용체는 현대 신약개발에서 45% 이상의 목표물질로서 그 중요성이 부각되어 있다.

클라스린 매개의 수용체 세포 내재화 (Clathrin mediated endocytosis) 경로는 세포내 존재하는 효소 결합 수용체, G 단백질 결합 수용체, 및 각종 이온 채널 결합 수용체와 같은 대부분의 종류의 수용체의 세포 내 이입을 조절하는 일련의 기전이다. 이 기전은 세포 막 상의 수용체의 발현 양을 조절하여 수용체 매개의 신호전달을 종료 시키거나 수용체에 결합되어 있는 리간드를 세포 내부로 흡입하는 등의 역할을 수행한다. 뿐만 아니라, 클라스린 매개의 수용체 세포 내재화 경로에서 수용체를 감싸는 주머니 역할을 수행하는 클라스린 피막은 굉장히 작은 면적에 수용체를 운반함과 동시에, 그로 인해 상승된 수용체 국지 농도를 통해 수용체 활성을 유도하여 피막 자체로 수용체 신호전달을 매개 하기도 한다. 하지만 클라스린 피막의 숫자는 세포막에 수백개 정도로 그 수가 굉장히 제한적인 상황에 있다.

클라스린 매개의 수용체 세포 내재화는 위와 같이 세포 생장에 근간이 되는 경로이지만, 그 숫자가 제한적인 반면 처리 해야 할 수용체의 숫자는 굉장히 많다. 따라서 어떻게 이와 같은 양적 불균형을 극복하여 수용체 사이의 경쟁을 피해 질서정연한 과정을 이루는지 아직까지 그 기전에 대한 정확한 이해가 부족한 상황이다.

이러한 이해를 위해 본 연구에서는 초고해상도 현미경을 이용하여 살아있는 세포에서 클라스린 피막과 수용체의 움직임을 단분자 수준에서 관찰 할 수 있는 시스템을 구축 하였다. 또한 관찰된 결과를 분석하여 각각의 분자들이 움직이는 궤적을 추적하여 그로부터 단분자의 분산 속도, 시간에 따른 세포 상에서의 위치 등의 정량적 정보를 추출 해 낼 수 있는 분석방법을 개발하였다. 이를 이용하여 본 연구에서는 클라스린 피막과 수용체 사이의 상호작용을 살아있는 세포에서 실시간으로 측정할 수 있는 분산기반의 분자수준의 공존연구 (diffusion based molecular co-localization) 를 진행하였다.

분산기반의 분자수준의 공존연구 방법을 통하여 본 연구에서는 표피세포 성장 인자 수용체 (Epidermal growth factor receptor)의 클라스린 매개의 세포 내재화 과정을 관측 할 수 있었다. 이를 통해해, 표피세포 성장 인자 수용체가 기저 상황 하에서 클라스린 피막의 특정 부분 모집단 (subset)으로만 특이적이고 반복적으로 결합하는 클라스린 피막에 대한 표피세포 성장 인자 수용체의 전-분배를 확인 할 수 있었다. 특히 이 클라스린 피막 부분 모집단의 형성에는 PICALM 이라는 어댑터 물질을 특이적으로 포함하는 것이 필수 조건임을 확인 하였다. 또한 표피세포 성장 인자 수용체 특이적으로 전-분배 되어 있는 클라스린 피막 부분 모집단은 트렌스페린 수용체 (Transferrin receptor)와 같은 다른 종류의 수용체와 상호 배타적으로 클라스린 피막을 분배하고 있음을 확인 할 수 있었다. 이와 반대로 같은 종류의 수용체인 ErbB2 의 경우에는 그것을 공유 하고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 이로 말미암아 본 연구에서는 클라스린 피막에 대한 수용체의 전-분배는 다양한 종류의 세포막 수용체의 세포 내재화에 있어서, 한정된 양의 클라스린 피막을 이용하여 불필요한 경쟁 없이 질서정연한 과정을 수행 할 수 있는 근간이 되는 세포의 분자적 기전 임을 증명 하였다. 본 연구를 통해 확인 할 수 있었던 클라스린 피막의 부분 모집단이 특정 종류의 세포막 수용체 집단에 대해 공유되거나 상호 배타적으로 분배 되는 일련의 과정은, 세포막 수용체의 신호 전달 과정에서 동반 상승 효과를 내거나 혹은 독립적으로 조절 되어야만 하는 세포막 수용체 매개의 신호전달에 대한 성질을 세포막에서부터 클라스린 피막을 통하여 이미 제어 될 수 있다는 새로운 관점을 제시할 수 있을 것으로 사료되는 바이다.