Studies on the role of Capicua in liver diseases and its regulatory mechanisms

Abstract

Capicua (CIC) has been implicated in pathogenesis of spinocerebellar ataxia type 1 and cancer in mammals; however, the in vivo physiological functions of CIC remain largely unknown. Here I find that Cic hypomorphic (Cic-L-/-) mice have impaired bile acid (BA) homeostasis associated with induction of proinflammatory cytokines. I discovered that several drug metabolism and BA transporter genes were down-regulated in Cic-L-/- liver, and that BA was increased in the liver and serum whereas bile was decreased within the gallbladder of Cic-L-/- mice. I also found that levels of proinflammatory cytokine genes were up-regulated in Cic-L-/- liver. Consistent with this finding, levels of hepatic transcriptional regulators, such as hepatic nuclear factor 1 alpha (HNF1α), CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), forkhead box protein A2 (FOXA2), and retinoid X receptor alpha (RXRα), were markedly decreased in Cic-L-/- mice. Moreover, induction of tumor necrosis factor alpha (Tnfα) expression and decrease in the levels of FOXA2, C/EBPβ, and RXRα were found in Cic-L-/- liver before BA was accumulated, suggesting that inflammation might be the cause for the cholestasis in Cic-L-/- mice. Although many studies have suggested that CIC functions a tumor suppressor in various types of cancer, there is no report on the function of CIC in liver cancer. In this study, I identify a transcriptional repressor CIC as a suppressor of hepatocellular carcinoma (HCC) progression and a potential therapeutic target. Expression of CIC is posttranscriptionally reduced in HCC cells. CIC levels are correlated with survival rates in patients with HCC. CIC overexpression suppresses HCC cell proliferation and invasion, whereas loss of CIC exerts opposite effects in vivo as well as in vitro. The levels of PEA3 group genes, the best-known CIC target genes, are correlated with lethality in patients with HCC. Among the PEA3 group genes, ETV4 is the most significantly upregulated gene in CIC-deficient HCC cells, consequently promoting HCC progression. Furthermore, ETV4 induces expression of MMP1, the MMP gene highly relevant to HCC progression, in HCC cells, and knockdown of MMP1 completely blocks the CIC deficiency-induced HCC cell proliferation and invasion. My findings demonstrate that CIC is required for maintenance of normal liver functions and BA homeostasis and that CIC deficiency promotes HCC progression via upregulation of ETV4 and MMP1 expression. Therefore, CIC and its downstream molecular pathway could be considered as targets for treatment of chronic liver disease and metabolic disorders, and HCC.

Capicua (CIC)는 초파리에서 처음 발견되었고 사람에까지 잘 보존 되어있는 전사억제인자이다. 초파리에서 CIC는 배아발생, 날개 발달, 조직 패턴화 등에 역할을 하고 포유동물에서 CIC는 세포 외 기질 형성 조절 이상에 의한 수두증, 폐포 형성 이상증, 여포 T 보조세포의 분화에 역할을 한다고 알려져 있다. 그리고 CIC는 암에서 많은 연구가 진행되고 있는데 다양한 암에서 CIC의 mutation이 발견되었다는 보고가 있다. 최근에 전립선암과 폐암에서 CIC의 조절기작이 밝혀졌고 암 진행과정 및 전이를 억제하는 것이 보고된 바 있다. PEA3 group 유전자들 (ETV1, ETV4 그리고 ETV5)은 CIC의 알려진 타겟으로 잘 알려져 있고 이들 유전자는 유방암, 전립선암, 폐암 등에서 과발현 되어있다. CIC의 역할이 많이 보고되었음에도 불구하고 아직 간에서의 역할은 밝혀진 것이 없다. 따라서 본 연구에서는 인체 내 중요한 조직 중 하나인 간에서 생길 수 있는 질병으로 대사질환과 간암에서의 CIC 역할에 대해 각각 규명했다. 담즙 (Bile)은 지방과 지용성 비타민의 소화 흡수에 필요할 뿐 아니라, 간의 해독 작용을 통해 생성된 물질들이 담즙으로 녹아 들어가 체외로 배출되므로 체내 독성 물질 제거에 굉장히 중요하다고 알려져 있다. 담도분비장애는 간에서부터 시작되어 십이지장까지 이루어지는 담도계 (billary system)의 어느 곳에서 정체나 장애가 일어나서 정상적인 담즙이동이 이루어 지지 않는 경우를 말한다. 담도분비장애는 간 내 독성 물질 축적으로 인해 간 기능을 저하시키고, 만성 간질환과 대사 질환의 원인이 된다고 알려져 있다. 본 연구에서는 CIC 단백질이 신경계 외의 다른 조직인 간에서 역할을 할 수 있다는 사실을 밝혀냈다. CIC-L knockout (CIC-L-/-) 쥐에서 먼저 간에서 중요하게 작용하는 전사인자들인 FOXA2, RXRα 등의 발현량이 CIC-L-/- 쥐에서 현저히 떨어지는 것을 확인했다. 그리고 CIC-L-/- 쥐에서 담즙 이동에 필요한 유전자 뿐만 아니라 약물 대사 (drug metabolism)에 관여하는 유전자의 발현량이 모두 떨어진 것을 확인했다. 그로 인해 CIC-L-/- 쥐에서 염증유발 사이토카인 (proinflammatory cytokines)이 유도되면서 담즙산 항상성이 망가지는 증상을 보이는 것을 규명했다. 이로써 신경계 외에 대사 작용에 가장 중요한 조직인 간에서 CIC가 역할을 할 수 있음을 밝혀냈다. 간암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 세포증식과 악성을 높이는데 관여하는 유전자들의 발현을 변화시키면서 여러단계들에 의해 발전되는 질병이다. 간암 진행과정에 중요하게 작용하는 환경적인 요소나 세포 내 신호전달 경로가 많이 알려져 있음에도 불구하고 간암은 굉장히 복잡하고 장기간에 걸쳐서 진행되기 때문에 아직도 간암을 유도하는 정확한 작용 기전에 대해서는 모르는 부분이 많다. 본 연구에서는 전사억제인자인 Capicua (CIC)가 간암 진행을 억제하는 인자이고 간암 치료타겟으로 사용할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 먼저 간암환자 샘플에서 CIC의 단백질 발현량이 떨어져있고 CIC의 발현량이 낮을수록 생존율이 떨어진다는 것을 발견했다. 다음으로 간암세포주를 이용하여 CIC의 발현을 줄였을 때 간암세포의 증식과 침입능력이 증가한 것을 밝혀냈다. 이는 누드 마우스를 이용한 Xenograft 실험에서도 반복되는 것을 확인했다. 다음으로 CIC의 표적 유전자로 잘 알려진 PEA3 그룹 유전자들은 간암환자의 생존율과 유의미한 연관성이 있었다. 세포 수준의 실험을 통해 CIC는 간암에서 PEA3 그룹 유전자들 중 ETV4를 주요하게 타겟한다는 것을 알아냈다. 그리고 ETV4는 암진행과정에 많이 연관되어 있다고 알려진 MMP 유전자 중에서 MMP1의 발현을 직접적으로 증가시키는 것을 발견했다. 따라서 본 연구에서는 전사억제인자인 Capicua (CIC)가 ETV4-MMP1 메커니즘을 통해 간암 진행을 억제하는 인자이고 간암 치료타겟으로 사용할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 두 가지 연구를 토대로 현재 신경계에 국한되어 있던 CIC에 대한 기능 연구를 대사 작용에 가장 중요한 조직인 간에서의 연구로 확장함으로서 간 대사 작용과 간암에서 CIC-ATXN1/ATXN1L complex 기능을 이해하여 보다 넓은 견해를 제시한다.