Functionalized Bioreducible Polyethyleneimine with Peptide-based Targeting for Efficient Gene Delivery

Abstract

생명공학의 발전과 인간게놈프로젝트의 완성을 통하여 유전자 치료를 이용한 난치병의 치료는 여러 연구자로부터 큰 관심을 받아왔다. 초기의 연구자들은 유전자 치료를 위하여 바이러스를 이용한 전달 시스템을 개발하였지만, 안전과 관련된 여러 문제점이 발견되었다. 이를 대신하여 리포좀, 전기 충격, 덴드리머, 고분자와 같은 여러 구조적 형태를 보이는 비바이러스성 전달체가 개발되었다. 그중에서도 양이온성 고분자의 일종인 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI)은 개질화가 쉽고 뛰어난 유전자 전달 능력을 갖추고 있으므로 전도유망한 비바이러스성 전달체로 간주하고 있다. 하지만 BPEI는 분자량이 증가함에 따라 유전자 전달 효율과 독성이 같이 증가하기 때문에 이를 극복하기 위하여 연구자들은 이황화 결합 (disulfide linkage)를 BPEI의 사슬에 도입하는 시도를 하였다. 본 연구에서는 세포 수준 및 동물 수준에서 유전자 전달 능력의 향상을 위한 여러 가지 전략을 이용하여 환원형 BPEI (BPEI-SS)를 기반으로 하는 효율적인 유전자 전달체를 개발하였다. Chapter I에서는 유전자 치료에 대한 개요와 유전자 전달 시스템에 대하여 간략하게 설명하였고, 고분자를 이용한 유전자 전달 시스템에 대한 기본적인 배경지식 및 BPEI-SS와 이를 합성하는 방법에 대하여 알아보았다. 가교결합을 통하여 증가한 유전자 복합화 능력과 이황화 결합의 분해로 인한 쉬운 DNA의 방출을 통하여 환원형 BPEI는 높은 유전자 전달 효율을 보인다. 이 전략은 고분자의 구조와 세포 내 특수한 환원환경에 초점을 두어 BPEI의 유전자 전달 효율을 증가시켰다. Chapter II에서는 고분자-유전자 복합체와 세포막의 상호작용에 대하여 주목하였다. 세포막 표면에는 당단백질(glycoprotein)이나 인지질(phospholipid)로부터 carboxy, sulfate, phosphate와 같은 작용기가 존재하고, 구아니딘 (guanidine group)과 이좌배위 수소결합 (bidentate hydrogen bonding)으로 강한 결합을 할 수 있다. 구아니딘은 세포막 통과 펩타이드 (cell penetrating peptide)의 서열 중 주요한 아르기닌 (arginine)의 작용기이며, 세포막 통과 펩타이드는 세포 외부에서 내부로의 특정 전달체의 전달을 도와주는 역할을 한다. 이 점을 이용하여 해당 연구에서는 BPEI-SS에 구아니딘을 도입하여 세포막과 고분자-유전자 복합체간의 상호작용을 증가시켜 유전자 전달 효율을 높이고자 하였다. 구아니딘이 도입된 BPEI-SS (GBPEI-SS)는 구아니딘에 의한 일차 아민의 전하의 비편재와 환원능력을 통하여 낮은 세포독성을 보였다. 또한, 대조군보다 구아니딘에 의한 늘어난 세포 내 이입과 이황화 결합의 분해로 인한 효율적인 유전자의 방출로 인하여 향상된 유전자 전달 효율을 보였다. Chapter II에서는 세포 수준에서 BPEI-SS의 유전자 전달 효율의 향상에 대한 연구를 수행하였다. 이에 Chapter III에서는 생체 내 (in vivo)에서 BPEI-SS의 유전자 전달 효율을 증가시키는 데 초점을 맞췄다. 하지만 BPEI-SS는 강한 양이온성을 갖고 있으므로 생체 내에 주입되면 혈장 내의 혈장 단백질과 상호작용을 하여 전달 효율이 감소한다. 이러한 양이온성 고분자와 혈장 단백질 간의 직접적인 상호작용을 막기 위하여 폴리에틸렌글라이콜(polyethylene glycol, PEG)를 도입하였다. 또한, PEG 사슬 끝에 고분자-유전자 복합체를 우리가 원하는 표적 세포에 전달할 수 있게 해주는 RPM이라는 표적 펩타이드를 도입하였다. RPM 펩타이드는 침습성 대장암 세포에 과발현된 인테그린 수용체를 표적할 수 있다. 마지막으로 생체 내에서의 고분자의 거동을 관찰하기 위하여 적외선 영역의 형광을 방출하는 IR820을 도입하였다. 표적 펩타이드가 도입된 BPEI-SS는 그렇지 않은 BPEI-SS에 비하여 높은 세포 내 이입과 유전자 전달 효율을 세포 상에서 그리고 생체 내에서 보였다. PEG와 표적 리간드를 BPEI-SS에 도입하여 생체 내에서도 증대된 표적 효과와 유전자 전달 효율을 확인하였다. Chapter V에서는 표적 펩타이드의 구조에 주목하였다. 표피세포성장인자수용체(Epithermal growth factor receptor, EGFR)은 사람의 표피세포를 기원으로 하는 모든 암종에 과발현되어 있으므로 최근 유전자나 약물 전달시스템의 개발에 있어 많은 연구자들이 EGFR을 표적하는 전략을 사용한다. EGFR은 리간드의 결합이 없어도 이합체의 형태로 존재한다. 이러한 독특한 EGFR의 특징을 이용하여, 우리는 두 가지 종류의 표적 펩타이드를 구현하였다. 하나는 기존의 표적 펩타이드(GE11)이며 다른 하나는 두 개의 표적 펩타이드가 구부러진 형태로 묶인 펩타이드(bGE11)이다. 본 연구에서는 구조적 특징이 다른 두 가지 표적 펩타이드를 갖는 BPEI-SS를 합성하고 평가하였다. 표적 펩타이드가 도입된 고분자들은 종류에 상관없이 높은 유전자 전달 효율, 표적 지향성, 그리고 낮은 독성을 보였다. 그중에서도 bGE11 펩타이드가 도입된 BPEI-SS는 GE11 펩타이드가 도입된 고분자보다도 생체 내에서 더 높은 표적 지향성을 보였다. 리간드 구조의 변화로 인한 표적 효율의 향상을 통하여 본 전략이 표적 지향성 전달 시스템에서 유전자 전달 효율을 증가시키는 하나의 방법이 될 수 있음을 확인하였다.

Through progression of bioengineering and completion of human genome project, treatments of heredity disorder by gene therapy have drawn tremendous interest from many researchers. Early researchers had developed virus as gene carriers to deliver therapeutic genes to patients. However, there were severe problems related with safety issue. Instead of viral vectors, non-viral vectors have been developed with various kinds of formulations; liposome, electroporation, dendrimer and polymer. Among them, branched polyethyleneimine (BPEI), one of the cationic polymers, has been considered as one of the promising non-viral vectors due to its exceptional transfection efficiency and easy modification. In the use of BPEI, however, the fact that its transfection efficiency and cytotoxicity are proportional to increase of its molecular weight is issued. To address the impediment, researchers introduce bioreducible linkage (disulfide bond) to the backbone of PEI. In this thesis, advanced strategies to enhance transfection efficiency in vitro and in vivo level based on bioreducible PEI were presented. In Chapter I, we describe a brief overview of gene therapy and role of gene delivery system. Then simple background of polymeric gene delivery system was also explained. Finally, introduction of bioreducible polyethyleneimine (BPEI-SS) and various synthetic methods of BPEI-SS were featured. Enahnced gene condensation ability through crosslinking and easy DNA release via cleavage of disulfide linkage lead to high transfection efficiency of BPEI-SS. In other words, this strategy is only focused on structure of carriers and intracellular events. In Chapter II, we were concentrated on the increase of the interaction between plasma membrane and polyplex. In plasma membrane, there are carboxy, sulfate, and phosphate group from glycoprotein and phospholipid, which well interact with guanidine group through bidentate hydrogen bonding. The guanidine group is found at a residue of arginine, a major amino acid in sequence of cell penetrating peptides that help molecular cargos to penetrate into cells. Therefore, in this study, we introduce guanidine group to BPEI-SS (GBPEI-SS) to enhance interaction between polyplex and plasma membrane. GBPEI-SS showed negligibly significant toxicity due to its bioreducibility and delocalizing of the positive charge of the primary amine in BPEI by guanidine group. Compared with BPEI-SS without guanidine group, GBPEI-SS showed enhanced transfection efficiency owing to increased cellular uptake and efficient pDNA release by cleavage of disulfide bond. This system is very efficient for delivering pDNA into cells, thereby achieving high transfection efficiency and low cytotoxicity. Up to the Chapter II, we focused on enhancing transfection efficiency of BPEI-SS in vitro level. In Chapter III, we further changed our view to apply BPEI-SS for in vivo application. For one thing we had to take a careful look on in vivo experiment, however, was the serum stability of it since the highly positively charged BPEI-SS interacts well with serum protein in bloodstream. Therefore, we functionalized BPEI-SS with polyethylene glycol (PEG) which prevents the direct interaction between cationic polymer and anionic serum proteins. In addition, we introduced RPM peptide, targeting peptide, at the end of PEG chain to deliver polyplex to specific site. The peptide can bind with integrin receptor overexpressed in invasive colorectal cancer (CRC) which is one of the leading causes of cancer-related deaths worldwide. Finally, IR820 which emits NIR fluorescence is also conjugated to BPEI-PEG-RPM to visualize polymers in vivo. The synthesized RPM-conjugated gene carrier formed a compact polyplex with pDNA that had low toxicity. Furthermore, the RPM-conjugated polymer not only had higher cellular uptake in invasive colon cancer than the non-targeted polymer, but also showed enhanced transfection efficiency in invasive colon cancer cells in vitro and in vivo. Introduction of PEG and targeting ligand to BPEI-SS showed enhanced targeting ability and transfection efficiency in vivo level. In Chapter IV, we focused on the structure of targeting ligands. Epithermal growth factor receptor (EGFR) has been considered as one of the promising targets for gene and drug delivery system because of its overexpression in human cancers from epithelial origin. EGFR is used to exist as preformed dimers in the absence of ligands. Inspired by theis unique phenomenon of EGFR, we designed the targeting peptide in two different types. One is normal peptide (GE11) and the other is branched peptide (bGE11) which has two ligands in one peptide. In this study, two kinds of BPEI-SS-PEG-peptide which have structurally different targeting ligands were synthesized and evaluated. Our results demonstrated that GE11 or bGE11-tethered gene delivery carriers showed efficient gene condensing ability, enhanced transfection efficiency and targeting ability with low cytotoxicity. Interestingly, bGE11-tethered polymer showed the higher targeting ability to EGFR-overexpressed cancer cells in vivo than the GE11-tethered polymer. Therefore, this branched structure of targeting ligand has the potential for providing the novel strategy to design efficient targeted delivery system.